2018 Fiscal Year Research-status Report
16員環マクロライド・ジョサマイシンによる抗インフルエンザウイルス作用機序の解明
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17K18120
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
菅又 龍一 帝京大学, 公私立大学の部局等, 講師 (70595917)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ジョサマイシン / インフルエンザAウイルス / A(H1N1)ウイルス / 抗インフルエンザAウイルス活性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
16員環マクロライド・ジョサマイシン（Leukomycin A3）による抗インフルエンザウイルス活性メカニズムにアプローチするため、インフルエンザA/H1N1ウイルスに感染した肺胞由来のA549細胞をジョサマイシンを添加した培地で培養し、72時間後に培養上清中に出芽したウイルスの力価（感染力価）を測定したところ、ジョサマイシンはIC50=20 microMでウイルスの力価を抑制することが明らかになった。ウイルスが感染してからおよそ8時間後に宿主細胞から出芽することを明らかにし、ウイルスを低濃度（1500 pfu)と高濃度(2,000,000 pfu)でそれぞれ感染させて、最初の娘ウイルスが宿主細胞内で増殖し、出芽したタイミングで培養上清のウイルス力価を測定したところ、どちらのウイルス感染濃度においてもジョサマイシンはIC50=20 microMで力価を抑制し、ジョサマイシンは感染ウイルスの濃度に依存せずにウイルスの増殖を抑制することが分かった。
一方で、出芽する直前（感染7時間後）の宿主細胞内におけるウイルス遺伝子の転写発現レベルを測定したところ、全10種類存在するウイルス遺伝子の核酸レベルは、いずれもジョサマイシンの投与で影響を受けていないことが明らかとなかった。ウイルス遺伝子の転写物がウイルスタンパク質への翻訳過程を抑制している可能性を考え、宿主細胞内のウイルスタンパク質の産生量がジョサマイシンによって変化しているかをウェスタンブロッティング法にて解析したところ、ウイルスタンパク質の産生量は抑制されていないことがわかった。現在は娘ウイルスが細胞外に出芽する際にジョサマイシンが抑制的に働いている可能性を追究している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
研究以外の大学内の業務が増加してきており、思うように研究を進められていない状況にある。加えて、当方ラボでは、国費留学生（ベトナム国籍）を受け入れており、研究に関する経験が乏しい上、日本語も英語も十分に話すことができない留学生の指導教官を務めている。そのため、申請書類、研究ストラテジーの立案、実際の実験などその全域にわたりサポートが必要である。本年が留学生の最終年度（D4）ということもあり、自身の研究の遅延が生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
親ウイルスが初めに宿主細胞に結合して感染する際か、娘ウイルスが出芽して再び宿主細胞に感染するとき、またはその両方の段階でジョサマイシンがウイルスの宿主細胞への結合を阻害しているかどうかを見極めるため、フローサイトメトリーで解析する必要がある。ウイルスそのものは微小であるため、フローサイトメトリーでは検出できない。しかし、ウイルスが細胞に結合している状態であれば、蛍光標識の特異抗体を用いて陽性細胞として検出できる。したがって、ジョサマイシン存在下、非存在下で宿主細胞に結合したウイルスのHAあるいはNA分子を蛍光抗体にて検出することにより、ジョサマイシンによる結合阻害を検討する。
また、仮にフローサイトメトリーを用いた実験が軌道に乗らなかった場合には、代替の手法として、MALDI-TOF/MS(マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析）を用いて、ウイルスが細胞に結合するために必須で唯一の分子であるHAとジョサマイシンとの結合有無を検討する方法を実行したいと考えている。
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| Causes of Carryover |
研究計画では、ジョサマイシンによる抗ウイルス活性を調べる戦略手段にフローサイトメトリーによる研究を第一選択としているが、この手法に必要とされる（HA)あるいはノイラミニダーゼ（NA）に対する一次抗体と、この結合を検出するための蛍光標識された二次抗体をまだ購入していない状況である。また、代替手法として位置付けているMALDI-TOF/MSによる解析に必要とされる試薬についても購入しておらず、これらの主な理由により次年度使用額が生じている。
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| Remarks |
北里大学と「インフルエンザ誘発性呼吸器疾患に対する治療薬の開発」についての共同研究を行っています。
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Research Products
(4 results)
