2017 Fiscal Year Research-status Report
G9aによるosteogenic frontの増殖と分化の制御
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17K18196
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| Research Institution | Tsurumi University |
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Principal Investigator |
出野 尚 鶴見大学, 歯学部, 学部助手 (40435699)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ヒストンメチル化 / G9a / Senescence |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ヒストンメチル化酵素G9aがOsteogenic frontの骨芽細胞の増殖と分化を制御するとの仮説に基づき、前駆骨芽細胞が分化へ至る過程でG9aが細胞周期関連遺伝子の発現を統合的に制御する仕組みを明らかにする事を目的としている。
これまでの基礎的データからG9a欠損がSenescenceを惹起していることが考えられたため、平成29年度は、in vitroのG9a欠損骨芽細胞にて特異的な発現変動を示すSenescence関連遺伝子群の探索をおこなった。具体的には、G9a flox/floxマウスの頭蓋冠由来骨芽細胞とCre発現アデノウイルス(Ad/Cre)またはコントロールアデノウイルス(Ad/Cont)を用いて、G9a欠損骨芽細胞（KO細胞）と野生型骨芽細胞（コントロール細胞）を作出し、これらの細胞を分化培地にて７日間培養した後にRNA抽出をおこなった。これらのRNAを用いたSenescence 関連遺伝子の発現解析はCellular Senescence RT2 Profiler PCR Array（QIAGEN）によって実施した。
その結果から、G9a欠損骨芽細胞の発現が野生型骨芽細胞に比べて2倍以上の発現亢進が認められた遺伝子は16個、2倍以上の発現抑制が認められた遺伝子は10個が抽出された。発現亢進が認められた遺伝子群には、既にSenescenceのマーカーとして提案されているp21が含まれていた。現在、発現亢進が認められた遺伝子群の中から、その発現制御にG9aやRunx2の関与が予想される遺伝子をクロマチン免疫沈降法（ChIP）のデータベースを活用しながら絞り込みを進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
in vitroで作出したG9a欠損骨芽細胞とコントロール細胞の発現をCellular Senescence RT2 Profiler PCR Array（QIAGEN）で比較した結果から、既知のSenescenceマーカーを含む複数遺伝子を抽出することができた。この結果をもとに、次年度以降予定しているクロマチン免疫沈降法（ChIP）を用いたG9a、Runx2の発現制御機構の解析の準備が進められている。したがって、研究計画に従った結果が蓄積しつつあり、概ね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
G9a欠損骨芽細胞の発現が野生型骨芽細胞に比べて2倍以上の発現亢進が認められたSenescence関連遺伝子は16個と多いため、現在進めているクロマチン免疫沈降法（ChIP）のデータベース等を多く活用しwetの実験に進める遺伝子の絞込み・検討を十分におこなう。その後、in vivoでの発現変動をin situ hybridization、免疫組織化学にておこなう。また、G9a欠損骨芽細胞とコントロール細胞を用いたChIP解析で絞込んだ遺伝子の制御領域について調べる。
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| Causes of Carryover |
細胞培養を用いた実験が効率良く遂行できたため、試薬等の使用が想定より少なく抑えられ、次年度使用が生じた。次年度はin situ hybridizationおよびChIPによる詳細に解析を必要とする実験が増えるためそこで使用する試薬の購入にあてる。
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