GUS-D6を用いた新たなCSPG分解療法の確立とそのALSへの応用

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K18226
• Research Institution: Suzuka University of Medical Science
• Principal Investigator: 及川 弘崇 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 助教 (00732041)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: Native GUS 中枢移行性 / GUSによる神経細胞伸長補助

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではβ-グルクロニダーゼ(GUS)によるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の分解能力を利用し、家族性筋萎縮性側索硬化症(ALS)性神経障害の治療法の確立を目的としている。ALSのモデルラットにおける運動神経の主病変部位にCSPGの進行性の沈着が起こる事が報告されておりCSPGの沈着は、神経突起伸長を阻害し、神経回路網の再構築を妨げる事が知られている。よってGUSの応用の有効性は推察できる。初年度ではマウス脊髄由来神経芽細胞腫であるNeuro-2aの培養系を用いて、CSPG条件下でのNeuro-2aの細胞体の減少を5,000 U/g のGUS投与によって抑制することを観察している。また、β-グルクロニダーゼ(GUS)投与群で神経細胞特異的マーカーであるMAP-2の陽性タンパク質の増加と軸索様形態が観察された。これにより、GUS-D6の神経細胞への有用性が推察された。そして、次年度ではALPマウスに投与するのに先駆けて、自然型のマウスを用いて、GUSの酵素組織移行性について検討した。250 U/mL のNative GUSをマウス尾静脈注射で投与し、投与20分後の大脳皮質と脊髄を摘出してGUS酵素活性を検討した。その結果、平常時よりも大脳皮質では2倍、そして脊髄では2.5倍の濃度のGUS活性が確認され、Naitive GUSであっても中枢神経系への移行性があることが観察された。そして3年目では初年度と同様の試験をラット大脳皮質由来初代培養神経細胞でも観察できるかを確認したのだが、現在のところその再現が取れていないのが現状である。また、一方ではALPモデルマウスへNative GUSよりも脳移行性が3倍ほど改善され、半減期も6倍ほどの延びたGUS-D6の投与計画を検討中であり、使用量に応じた酵素精製が必要なため、酵素精製も進行中である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

研究代表者が在籍する分野主要構成員が退職した後、欠員分の補充採用がなされなかった。そのため、酵素精製スピードに遅延が生じている。
前年度から遅延の理由の最大原因として、本研究計画申請後にアメリカ合衆国大統領が変ったことにより、組み換え遺伝子を持つベクターといったような生物学的資源の移譲や分譲の規則が厳しく変更になったため、ベクター入手までに予想以上の時間がかかっているということがあったが、結果としてrecombinantのGUS-D6のベクターの入手が不可能となり、native型のベクターを入手した。その後、GUS-D6型を遺伝子導入したCHO-K1細胞の生成増殖作業が遅延しており、酵素活性の高いクローンの絞り込みが追いついていない状態であり、想定以上に時間を要している。
ALSモデルマウスの導入に関して移譲を許可いただいた研究グループが国内にあり、学校設備の確認譲渡申請書と許可証など必要書類や受け入れ態勢を整えていた。しかしながら、移譲最終段階で譲渡元の研究グループ事由によりALSモデルマウスが一時コンベンショナルな状況を介していたことが直前で判明し、急遽動物移譲取り止めとなった。そのためALSモデル動物を別途購入し、必要数のモデルマウスを準備する必要が出たため、想定以上に時間を要している。以上の事由により、「遅れている」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

今後とも、GUS-D6の酵素精製を最優先課題とする。同時に、GUSの中枢位構成も短期間においては確認できているので、GUSを用いた全臨床試験も遂行する予定である。また、GUS-D6の神経系への及ぼす影響について神経突起伸長マーカー(Gal-1,GAP43)や樹状突起マーカー(MAP-2)をウエスタンブロット法(WB)や免疫染色法(IHC)によって精査する。必要量のGUS-D6が確保できれば初年度研究計画と次年度研究計画を随時検討可能であり、本研究目的は十分に達成可能である。前臨床試験を行うためにALSモデルマウスが必要となるが、出生後4ヶ月後よりALS症状を発症するが、ジェノタイピングによりモデルマウスを絞り込み、早期より酵素治療を行い、生後4ヶ月時点での症状の発症比較から行う。また投与計画においては、GUS-D6の薬物動態結果を基準として、5,000 U/g/weekでライソゾーム病モデルマウスの脳内で治療効果を得られていることから、5,000 U/gの条件で長期投与計画を固定する。また、Native GUSをネガティブコントロールとして同条件で長期的な酵素治療を行い、GUS-D6の有効性を確定する。

Causes of Carryover

Nativeベクター入手までのスケジュール変更の影響により酵素精製スケジュールの大幅遅延が続いていおり、投与開始時期の変更を余儀なくされている。当初は初年度に必要量の酵素精製がある程度進み、酵素確保をある程度する予定だったが現在は同時進行状態である。本年度は酵素精製に必要なグラディエントポンプ(Bio-Rad: 731-9001JA)と培地や精製フィルターといった酵素精製用消耗品の購入を予定している。