GUS-D6を用いた新たなCSPG分解療法の確立とそのALSへの応用

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K18226
• Research Institution: Suzuka University of Medical Science
• Principal Investigator: 及川 弘崇 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 助教 (00732041)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: GUS-D6 / Native GUS / ALSマウス / β-グルクロニダーゼ

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではβ-グルクロニダーゼ(GUS)によるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の分解能力を利用し、家族性筋萎縮性側索硬化症(ALS)性神経障害の治療法の確立を目的としている。
GUSはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の分解作用を持つため、ALSのモデルラットにおける運動神経の主要病変部位に蓄積するCSPGも分解する可能性が推察されていた。
初年度ではマウス脊髄由来神経芽細胞腫であるNeuro-2aの培養系を用いて、CSPG条件下でのNeuro-2aの細胞体の減少を5,000 U/g のGUS投与によって抑制することを観察している。また、β-グルクロニダーゼ(GUS)投与群で神経細胞特異的マーカーであるMAP-2の陽性タンパク質の増加と軸索様形態が観察された。3年目では初年度と同様の試験をラット大脳皮質由来初代培養神経細胞での再現が取れなかったのだが、4年目に適用する5,000 U/gのGUSの濃度を2500 U/gから500 U/gと段階的に減量することにより、有意ではないものの、初代培養神経細胞の細胞体減少の抑制が観察された。また、MAP-2の陽性タンパク質に関して有意な差異は観察されなかったが、GUS投与群において軸索様形態の成熟に影響を及ぼしていた。一方、2年目の検討においてALSマウスに投与するのに先駆けて、自然型のマウスを用いて、GUSの酵素組織移行性について検討を行い、。250 U/mL のNative GUSの投与において大脳皮質では2倍、そして脊髄では2.5倍の濃度のGUS活性が確認している。Native GUSよりも脳移行性が3倍ほど改善され、半減期も6倍ほどの延びたGUS-D6の投与計画を検討中であり、使用量に応じた酵素精製が必要なため、酵素精製も進行中である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

In vitro実験において、CSPG条件下でのNeuro-2aに対する5,000 U/g Native GUSの投与により、CSPG適用による細胞体数の減少抑制とMAP-2陽性タンパク質の増加と軸索伸長様作用が観察された。初代培養神経細胞ではCSPG条件下による細胞体数減少抑制が2,500 U/g Native GUS以下から観察され、MAP-2陽性タンパク質に関しては有意な差異は観察されなかったが、軸索様形態の成熟速度に若干影響が観察された。
In vivo実験においては250 U/mL のNative GUSをマウス尾静脈注射で投与し、投与20分後の大脳皮質と脊髄を摘出してGUS酵素活性を検討したところ、未処置のマウス大脳皮質よりも2倍、そして未処置のマウス脊髄よりも2.5倍の濃度のGUS活性が確認され
一方で、昨年度に報告した、研究代表者が在籍する分野主要構成員が退職した後の欠員分の補充採用がない状況下で、新型コロナウイルス流行の結果、遠隔講義対応が既存の科目と新科目で余儀無くなった為、酵素精製スピードに遅延が生じている。
現在はNative GUS酵素精製を行っており、それと並行してGUS-D６の酵素精製を行っていたのだが、酵素活性の高かったクローンが失活したためリクローニングを行った。しかしながらら、酵素活性の高いクローンを得られなかったため、再度GUS-D6の遺伝子導入したCHO-K1細胞の生成を行っているため遅延が起きている。
実験に使用する酵素量の十分な確保がALSモデルマウスを使用した全臨床試験の律速となっている。以上の事由により、「遅れている」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

今後とも、GUS-D6の酵素精製を最優先課題とする。同時に、GUSの中枢位構成も短期間においては確認できているので、GUSを用いた前臨床試験も遂行する予定である。また、これまでのNative GUSとGUS-D6の神経系への及ぼす影響についてのin vitro実験の結果をまとめ、論文とし社会還元する。
必要量のGUS-D6を確保したのち速やかに前臨床試験を行い当初予定の結果を本年度中にまとめ、学会発表や論文の形で社会還元する。具体的には、ALSモデルマウスに関しては随時ジェノタイピングによりモデルマウスを絞り込み、早期より酵素治療を行い生後4ヶ月時点での症状の発症比較を行い、酵素の影響を精査する。長期投与計画においては、GUS-D6の薬物動態結果を基準として決定はするが、5,000 U/g/weekを始めとして随時酵素濃度を下げることで、GUS-D6の精製遅延をカバーする計画を再設定する。その際、Native GUSをネガティブコントロールとして同条件で長期的な酵素治療を行い、GUS-D6の有効性を確定する。

Causes of Carryover

GUS-D6酵素精製のスケジュールの大幅遅延が続いているため、初年度に購入した酵素精製用消耗品で回っている状態であったが、必要酵素量の確保のため、スピードアップが必要であるため、酵素精製に必要なグラディエントポンプ(Bio-Rad: 731-9001JA)と培地や精製フィルターの購入を予定している。ALSモデルマウスの購入も予定である。