2017 Fiscal Year Research-status Report
新たな非対称性ジメチルアルギニン分解活性測定法の開発と機能性食品成分探索への展開
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17K18275
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| Research Institution | Mukogawa Women's University |
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Principal Investigator |
横路 三有紀 武庫川女子大学, 生活環境学部, 助教 (80757188)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 非対称性ジメチルアルギニン / ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドラーゼ / プルダウンアッセイ / 免疫沈降 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
非対称性ジメチルアルギニン（ADMA）は、新たな心血管疾患発症リスク因子であるとして注目されている。したがって、体内に蓄積したADMAを減少させることが疾病の発症、増悪の抑制に重要であると考えられるが、体内ADMAを低下させる有力な方法はまだ明らかとなっていない。ADMA低下作用を有する食品成分の探索を行うためには細胞内ADMA分解（DDAH-1）活性を一度に多検体評価可能なアッセイ系が必要である。本研究は、蛍光共鳴エネルギー移動を利用したDDAH-1活性バイオセンサーを開発し、スクリーニング系を確立することを目的とする。
本年度の予定は、ADMA認識特異的にDDAH-1に結合するタンパク質、もしくはペプチドの探索を進めた。DDAH-1トランスジェニックマウスの肝臓抽出液を用いて、ADMA添加と非添加条件下で免疫沈降を行った。溶出物はSDS-PAGEで分離し、CBB染色でタンパク質パターンを確認した。しかしながら、この方法ではADMAの有無によりDDAH-1結合するタンパク質の明確な違いは認められなかった。つぎに、ADMA添加濃度など条件を振って結合タンパク質の同定を行うため、Hisタグ融合型DDAH-1を用いたプルダウンアッセイを行うこととした。本年度は、大腸菌による組み換え型DDAH-１発現を行い、Hisタグ融合型DDAH-1が溶出画分に出てくることを確認したところまで進めることができた。次年度は、発現に成功したHisタグ融合型DDAH-1を用いたプルダウンアッセイを行い、DDAH-1結合タンパク質の同定を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
免疫沈降法では明確な結果が得られなかったためHisタグ融合型DDAH-1を用いたプルダウンアッセイを行うこととしたが、大腸菌発現系によるHisタグ融合型DDAH-1の発現に予定より手間取り、時間がかかった。
現在は、可溶化されたHisタグ融合型DDAH-1発現を確認したので次年度はプルダウンアッセイを行い、DDAH-1結合タンパク質の同定を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は引き続き、ADMA認識特異的にDDAH-1に結合タンパク質の同定を進める。また、FRETを応用したアッセイ系の確立に向けた他の戦略としてDDAH-1のホモダイマー化条件の同定、シトルリン特異的なトランスポーターの探索とその利用可能性の検討を考慮に入れながら、研究を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
Hisタグ融合型DDAH-1発現が予定通りに進まず、プルダウンアッセイによる検討が行えなかったため、次年度への助成金の持ち越しが生じた。次年度は、本年度に行えなかったプルダウンアッセイ、DDAH-1のホモダイマー化条件の検討等を行い、FRETを利用したアッセイ系の作製まで進めたい。
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