2017 Fiscal Year Research-status Report
Comparative glycoproteomics for elucidating molecular mechanism of cardiac hypertrophy
| Project/Area Number |
17K18414
|
|---|
| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
岡谷 千晶 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (30633648)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 心肥大モデル / 比較グライコーム解析 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
心肥大・心不全に至る分子メカニズムの解明は、心不全治療法の開発における重要課題である。糖鎖修飾は、タンパク質の細胞内局在やプロセシングの制御などを介して、タンパク質機能を制御することが知られている。本研究は、肥大状態の心筋細胞において生じる糖鎖修飾の異常と心肥大シグナルとの関連性を探ることにより、心肥大シグナルにおけるタンパク質上糖鎖修飾の意義を分子レベルで明らかにすることを目的とした。
平成29年度は、まずin vitro心肥大モデルの作出条件を検討した。ラット心室由来心筋細胞を対象とし、肥大刺激としてangiotensin II、endothlin-1、phenylephrine、isoproterenolを曝露する際の条件を検討した。細胞面積およびアクチンフィラメント染色により肥大の程度を評価することにより、最適な培養条件（培地組成、コーティング剤および播種密度）、薬剤濃度および薬剤曝露時間を決定した。この検討の際に、レクチンアレイ（45種類のレクチンを搭載）を用いた比較グライコーム解析により、コーティング剤の有無や培地中の血清の有無によって全細胞抽出液の糖鎖プロファイルが変化することを見出した。
次に、決定した条件により薬剤を曝露した細胞（心肥大群）および薬剤を曝露していない細胞（対照群）から、培養上清、全細胞溶解液、細胞親水性画分・疎水性画分を調製し、レクチンアレイによる比較グライコーム解析を実施した。その結果、対照群と比較して心肥大群では、細胞疎水性画分の糖鎖プロファイルが変化することを見出し、その変化を検出するために有効なレクチンプローブを選出できた。
また、O型糖鎖のグライコプロテオーム解析に向けて、O型糖鎖生合成に関与する糖転移酵素をノックアウトしたラット心筋細胞の作出を進め、目的遺伝子をノックアウトした細胞プールの取得に成功した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
不死化ヒト心筋細胞に関しては、供給先の都合により細胞の入手が予定より遅れ、また、細胞の培養条件および保存条件の最適化に予想以上に時間を要したため、計画していた実験を年度内に十分に行えなかった。一方、ラット心室由来心筋細胞に関しては、１）分析試料調製法の決定、２）肥大刺激による糖鎖プロファイルの変化の解析、３）糖転移酵素ノックアウト細胞の作出、を計画通り順調に推進でき、肥大刺激による糖鎖プロファイル変化の検出に成功している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
まず、平成29年度に着手が遅れた不死化ヒト心筋細胞について、ラット心室由来心筋細胞を用いて確立した心肥大モデル作出条件・試料調製法・解析法を適用し、比較グライコーム解析およびグライコプロテオーム解析を推進する。N型糖鎖のグライコプロテオーム解析については、ラット心筋細胞の比較グライコーム解析では細胞疎水性画分にてN型糖鎖上の糖鎖変化が見られたことから、糖鎖変化を検出しうるレクチンプローブを用いて捕集した画分の解析に注力する。O型糖鎖のグライコプロテオーム解析については、既に糖転移酵素ノックアウト細胞が得られているラット心筋細胞について優先的に推進し、クローン化した細胞の表現型解析を行い、野生型と同様の刺激にて肥大がみられるかどうかを確認した後、グライコプロテオーム解析を実施する。
|
| Causes of Carryover |
研究実施に必要となる不死化ヒト心筋細胞の入手・実験のセットアップが遅れたために、遂行できなかった実験計画分の研究費を次年度に持ち越すこととした。これらの研究費は、次年度に実施する実験に使用する消耗品（試薬類、プラスチック器具等）に使用する。
|
-
-
-
-
[Journal Article] Impact of continuous reduction in B-Type natriuretic peptide bioactivity during hospitalization in patients with advanced heart failure2017
Author(s)
Hiroyuki Takahama, Seiji Takashio, Tomohiro Hayashi, Chiaki Nagai-Okatani, Toshio Nishikimi, Yasuaki Nakagawa, Makoto Amaki, Takahiro Ohara, Takuya Hasegawa, Yasuo Sugano, Hideaki Kanzaki, Satoshi Yasuda, Kenji Kangawa, Naoto Minamino, Toshihisa Anzai
-
Journal Title
Circulation
Volume: 136
Pages: A16248～A16248
Open Access
-
-
-
-
[Presentation] A comprehensive analysis of glycome profiles on formalin-fixed paraffin-embedded mouse tissue sections2017
Author(s)
Chiaki Nagai-Okatani, Shuichi Kakuda, Xia Zou, Maki Yoshida, Takashi Sato, Atsushi Matsuda, Kozue Hagiwara, Katsue Kiyohara, Yoko Itakura, Erika Noro, Masashi Toyoda, Sheng-Ce Tao, Yan Zhang, Hisashi Narimatsu, Atsushi Kuno
Organizer
16th Human Proteome Organization World Conress
Int'l Joint Research
-
-
-
-
[Presentation] Impact of continuous reduction in B-Type natriuretic peptide bioactivity during hospitalization in patients with advanced heart failure2017
Author(s)
Hiroyuki Takahama, Seiji Takashio, Tomohiro Hayashi, Chiaki Nagai-Okatani, Toshio Nishikimi, Yasuaki Nakagawa, Makoto Amaki, Takahiro Ohara, Takuya Hasegawa, Yasuo Sugano, Hideaki Kanzaki, Satoshi Yasuda, Kenji Kangawa, Naoto Minamino, Toshihisa Anzai
Organizer
American Heart Association Scientific Sessions 2017
Int'l Joint Research
-
