2018 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of degradation mechanism of crystalline carbohydrates by high speed and precision single molecule observation
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17K18429
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| Research Institution | Institute for Molecular Science |
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Principal Investigator |
中村 彰彦 分子科学研究所, 生命・錯体分子科学研究領域, 助教 (20752968)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | セルラーゼ / キチナーゼ / バイオマス / プロセッシブ運動 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
セラチア菌由来キチン加水分解酵素(SmChiA)については金コロイドをプローブとした高速高精度計測により、Burnt-bridge Brownian ratchetモーターであることが明らかになった。そこで観測バッファー中に主要生成物であるキトビオースを500 マイクロM混合して計測を行ったところ連続的な後退運動が観測された。更にこの1 nmサイズの後退運動後に再び１ nmの連続的な前進運動を再開していた。生成物を混入させた際にのみこの運動が見られることから、逆反応によるキチン分子鎖の合成の可能性が示された。もし合成反応なしに連続的な後退運動を行った場合、キチン分子鎖が基質結合クレフトから完全に外れてしまい酵素が解離してしまうと考えられる。しかしそうはならないことからもこの可能性が支持された。また高速原子間力顕微鏡を用いてキトビオース存在下での運動速度を計測したところ、濃度依存的な速度の低下が観測された。曲線回帰によりキトビオースのKiはマイクロM程度であることが明らかとなった。高速AFMでの計測ではステップ運動を観測することはできなかったが、運動速度は金コロイド修飾した酵素と同程度であったことから逆反応が起こっている可能性が考えられた。セルロース加水分解酵素のステップ運動計測については金コロイド固定位置を2箇所に増やし、より強固に固定化する必要がある。対象としているセルラーゼは大腸菌や酵母では活性型の酵素を得ることが難しい。そこでカビを用いたセルラーゼの発現系を有する研究者との共同研究を試みる。
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