2018 Fiscal Year Research-status Report
全ゲノム情報を活用したOutbreak関連大腸菌の下痢原性の解明
| Project/Area Number |
17K18439
|
|---|
| Research Institution | Osaka Institute of Public Health |
|---|
Principal Investigator |
原田 哲也 地方独立行政法人 大阪健康安全基盤研究所, 微生物部, 主任研究員 (70516723)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | Outbreak関連大腸菌 / 下痢原性 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
Outbreak関連大腸菌O166:H15についてCaco-2細胞およびT84細胞への付着性試験を実施した。Caco-2細胞については、事例患者由来株4株中3株でびまん性付着が確認されたが、陰性対照株として用いた食品由来株でも同様の付着性が認められた。また、T84細胞では、いずれの事例患者由来株についても付着は認められなかった。
2017年に発生したO166:H15食中毒患者由来株を含む事例患者由来株5株について、制限酵素XbaI処理によるパルスフィールドゲル電気泳動を実施したところ、すべての株でパターンが異なり、遺伝的関連性は示されなかった。
O166:H15について付着因子以外の病原因子候補を再度検索するため、これまでに得られた全ゲノムデータを用いてDDBJ Fast Annotation and Submission Toolによるアノテーションを実施し、事例患者由来4株と健康保菌者由来2株の共通遺伝子検索をIn Silico Molecular Cloning ソフトウェアを用いて実施した。結果として、事例患者由来4株のうち少なくとも3株が保有し、いずれの健康保菌者由来株も保有しない遺伝子は、165遺伝子であった。これら165遺伝子についてNCBIの遺伝子データベースと照合した結果、病原性への関与が推測される線毛や分泌装置に関係する遺伝子が同定された。
astA遺伝子のリファレンス配列について相同検索を実施したところ、事例患者由来の4株中3株で95.73%から98.29%の相同性を持つ配列が決定された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度は事例患者由来株のCaco-2細胞付着性と物質透過性を中心に検討する予定であったが、患者由来株で有意な付着が確認されなかったため経上皮電気抵抗値の測定は実施しなかった。事例患者由来のO166:H15について、大腸菌以外の病原因子を含めて病原遺伝子を再度精査したところ、収束線毛あるいは分泌装置に関連する遺伝子の保有が明らかとなった。現在、これらを評価するためのアッセイ方法の確立を目指している。
当初の計画よりも多くの遺伝子が病原因子候補として挙がっているため、特定に時間がかかっている。しかしながら、これらの絞り込みは着実に進んでおり、おおむね順調に進捗していると考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
最終年度である平成31年度は、主としてO166:H15の侵襲性に着目し研究を進める。コンタクトヘモライシス試験あるいは感染実験を実施し、ゲノム情報から得られた病原因子候補について精査する。また、必要に応じ病原因子欠損株を作出し、その表現型を野生株と比較する。新規の病原遺伝子が決定された場合は検出法を確立し、過去に大阪府で分離されたOutbreak関連大腸菌について、病原遺伝子の保有状況を調べる。また、事例患者由来O166:H15のastAについては、定量PCR法を確立し、その発現量を食品由来株や保菌者由来株と比較する。
|
| Causes of Carryover |
Caco-2細胞による経上皮電気抵抗値の測定が必要なくなったため、これに関する消耗品の購入がなかった。また、購入した実験動物が少なかったことも、次年度使用が生じた理由である。
次年度には、今年度実施できなかった2017年のOutbreakの患者由来O166:H15株の全ゲノム解析を実施する。また、侵襲性に関する実験、astAの遺伝子発現解析を実施予定でありまた、供試株の環状ゲノムデータが必要となる場合も想定されることから、研究費を計画的に使用する予定である。
|
