2018 Fiscal Year Annual Research Report
Studies on cryopreservation mechanism of intracellular trehalose introduced through trehalose transporter
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17K18834
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
内田 努 北海道大学, 工学研究院, 准教授 (70356575)
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2017-06-30 – 2019-03-31
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| Keywords | トレハロース / 凍結保存 / CHO-K1細胞 / トレハロース輸送体 / TRET1 / 緩慢凍結 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は細胞内へ導入されたトレハロースの、凍結保存時の働きを明らかにすることを目的として、トレハロースを細胞内に導入するタンパク質を発現したCHO-TRET1細胞と、通常のCHO-Vector細胞とを用いて、＜I＞トレハロースの細胞内導入による凍結保存メカニズムの解明、＜II＞細胞内外の水の状態の計測技術開発、の2課題を実施した。
＜I＞研究協力者（農研機構・黄川田主任研究員）より提供された各細胞を用いて凍結保存実験を実施し、本研究で導入した自動細胞計測装置を用いて生存率を調べた。その結果、CHO-TRET1細胞の最適保存条件が、細胞外トレハロース濃度400～500mM、凍結温度－100℃程度の凍結条件であることがわかった。この条件が何によって決まっているのかを調べるため、凍結前の細胞の健全性や、細胞内へ輸送されたトレハロース量の測定などを行った。また－80℃で長期間保存した場合の生存率変化を調べたところ、上記最適条件で凍結させても1年以上経過すると生存率が低下し始めることがわかった（国際会議で口頭発表、国内英文誌にて誌上発表）。
＜II＞初年度は、細胞内外の水の状態を模擬する微細な多孔質体を用いて、トレハロース含有培養液等の凍結・融解状態を把握するための計測技術の検討を行った。最終年度は、CHO細胞を含む系の計測に挑戦した。その結果、示差熱量測定、および粉末X線回折測定（産総研・竹谷主任研究員協力）では、課題Iで調べた条件の範囲内では氷Ih結晶の存在だけが示された。一方THz分光測定（名古屋大・竹家講師協力）では、他手法で氷Ih結晶のみ観測されていた低温度領域で、液相によるTHz波吸収が観測された。0℃以下での液相の存在は、凍結状態での細胞の機能維持や細胞内水のガラス化・再結晶化現象に大きな影響を及ぼすと考えられるので、その存在の検証や量的把握等更なる検討が必要である。
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