2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of a simple and rapid quantification method of pathogenic bacteria and drug-resistant bacteria based on fluorogenic substrates
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17K18894
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
佐藤 久 北海道大学, 工学研究院, 准教授 (80326636)
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2017-06-30 – 2019-03-31
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| Keywords | センサ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
大腸菌は糞便汚染の指標であり，大腸菌群に変わる指標細菌として利用することが議論されている．現在の大腸菌数測定法は，培地の作製，希釈，18時間以上の培養，陽性の判定作業など多大な労力を要する．そこで本年度は，特定酵素基質培地法を液体培地に適用しこの課題を解決することとした．具体的には，マイクロプレートリーダー内で下水処理水を37℃で培養しながら蛍光強度の経時変化を測定することにより，下水処理水中の大腸菌数を測定することを試みた．さらに測定時のDNAおよびmRNA量を定量し，測定時の酵素生成メカニズムを明らかにした．uidA遺伝子コピー数（すなわち大腸菌数）は4時間以降に対数増殖した．4時間以前はuidA量は検出限界（65 copies/μL）以下であった．mRNAも4時間以前は検出限界以下であった．MUの蛍光強度（すなわち酵素活性）は5.5時間から急激に増大した．これら3データを比べると，大腸菌対数増殖開始（5時間）とmRNA発現開始（6時間）には少しタイムラグがあるが，mRNA発現とMU生成（すなわちGUSとMUGの反応）にはタイムラグがない．よって，mRNA発現からGUSが生成され基質であるMUGと反応する一連の流れは短時間で起こることがわかった．
ここで注目すべきは，uidAが検出限界以下である4時間以前でもMUの蛍光が検出されていることである．このことは，終沈水中（の大腸菌細胞内）に十分な量（マイクロプレートリーダーで検出可能な蛍光強度に達する量のMUGを分解できる量）のGUSがすでに（大腸菌を培養しなくても）存在していることを示している．蛍光強度の傾き（これは基質（MUG）分解速度に等しい）が直線であることは，酵素反応がゼロ次関数，すなわち酵素濃度が一定であることを示している．このように，大腸菌簡易測定法の開発に成功した。
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