2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of novel in situ crosslinked hydrogel using lectins
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17K19006
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
伊藤 大知 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (50447421)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
太田 誠一 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 助教 (40723284)
津本 浩平 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 教授 (90271866)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2019-03-31
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| Keywords | ハイドロゲル / レクチン / TSG-6 / 炎症 / リンクモジュール |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では創傷治癒で形成されるレクチン／ヒアルロン酸複合体ゲルを模倣したin situ架橋ハイドロゲルを実現し，MSCなどの細胞源を用いずとも，抗炎症効果や増殖効果を持つ組織工学・再生医療用のinjectableな足場材料の開発を目標としている．特にヒアルロン酸に特異的に結合するレクチンである抗炎症性タンパク質TSG-6のLinkモジュールをベースにしたタンパク質を開発し，ゲル開発を行うことを目標とした．最近報告されたCHO細胞を用いたTSG-6の大量生産の論文（Kim, Dong-K et al. PLOS ONE 2016(11) e0147553）を参考に，GenbankよりAccession Number(BC030205)の配列を用い，この目的配列をVector(pcDNA3.4topo)に組み込んだ．JM109 (コンピテントセル) を用いてクローニング，プラスミドの作製を確認した．得られたPlasmidをExpi293細胞にトランスフェクションし，7日間にわたって培養した．発現はウエスタンブロットで確認したものの，His-tag精製が難しく，ヒアルロン酸分解酵素やグアニジン塩酸塩を用いた改良プロトコールでも精製が難しかった．Expi293細胞を用いることで糖鎖修飾が比較的正確に行われるメリットがあるが，精製の難しさから，大腸菌を用いた発現系への方針転換を行った．またHis-tag配列とTSG-6の配列が近すぎることでHis-tag精製がスムーズに進まない可能性も考慮し，間にSUMO-tagを介することでHis-tag精製の効率化を図るとともに，His-tagの除去を行える方針で研究を遂行中である．精製が非常に難しいタンパク質であり当初の目標に対して達成率は100%ではないが，最終目標に至るための多くの知見を獲得することができた．
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