2018 Fiscal Year Research-status Report
Formation and characterization of heterocellular aggregates prepared with cellular furoshiki
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17K19016
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
神谷 典穂 九州大学, 工学研究院, 教授 (50302766)
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2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | 細胞培養 / ハイドロゲル / 細胞集塊 / 酵素 / 増殖因子 / 酸化還元反応 / 細胞シート / 区画化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、酵素反応を介した酸化還元応答型ハイドロゲル形成を利用し、異なる形態と次元を有する細胞集塊からなるミニ組織構造の形成を目標とする。昨年度の実績を踏まえ、当初の目標であった異次元細胞集塊からなる異種細胞複合構造の形成を試みた。まず、シート状細胞構造体（細胞シート）の形成について、最適なチオール化ゼラチンとヘパリンの組み合わせを精査したところ、ゼラチンの前処理の違いがヘパリンとのハイブリッドゲルの形成において極めて重要なことを見出し、結果として、複数の増殖因子の包括固定と徐放を同時に達成することに成功した。これにより、NIH3T3線維芽細胞ならびにヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC細胞からなるシート形成の促進に成功した。次に、ハイドロゲル内部でのヒト肝癌由来HepG2細胞からなるスフェロイドの形成と、ハイドロゲル上部での細胞シート形成を同時に進行させることは可能なことを確認できたが、細胞シートの足場となるゲルの崩壊により、スフェロイドと細胞シートを融合することは困難であった。そこで、別途作製したスフェロイドを、ゲル上に接着・伸展しながら形成する細胞シートの上部に添加し、適当な条件下で足場を崩壊させるという新たなアイデアを検証したところ、目標とした細胞シートでスフェロイドをラッピングすることが可能なことを見出し、概念実証が可能な系であることを確認した。また、任意のペプチド・タンパク質成分を捕捉可能な部位として設計した融合タンパク質が導入された新規ハイドロゲルを足場として用いた細胞培養系を確立し、増殖因子と細胞接着ペプチドの同時導入による細胞増殖の高効率化を達成した。さらに新しい細胞培養の場としてリキッドマーブルを取り上げ、その内水相での生化学反応の進行ならびにハイドロゲル化の同時進行が可能なことを確認し、細胞培養の場としての可能性を評価した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）異次元細胞集塊の同一反応場における形成と細胞集塊のラッピング
チオール基修飾4分岐型ポリエチレングリコールと、チオール基修飾ゼラチンならびにヘパリンからなるハイブリッドゲルを調製し、その物理化学的特性を評価した。その結果、前処理方法の異なるゼラチンがヘパリンとのハイブリッドゲル形成と物理化学特性に多大な影響を与えることが明らかとなった。最適化されたハイブリッドゲルに、複数の増殖因子を包括固定し、ゲル上でNIH3T3線維芽細胞ならびにヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC細胞を培養したところ、２次元状の細胞シートの形成速度は足場となるゲルの特性と増殖因子の有無により大きく異なり、シート形成を効果的に促進可能な条件を決定することができた。その上で、市販のスフェロイド形成用プレートで作製したヒト肝癌由来HepG2細胞からなるスフェロイドを上述の細胞シート上に播種し、伸展した細胞シートの足場を還元条件下で崩壊させたところ、シートの収縮に伴い、スフェロイドが包括ラッピングされる様子が観察され、概念実証が可能なことを確認した。
２）異種細胞増殖因子の捕捉・徐放が可能なハイドロゲルの設計と評価
SpyTag融合塩基性線維芽細胞増殖因子とビオチン化細胞接着促進ペプチドを捕捉可能な新規融合タンパク質を設計し、これが導入された新規ハイドロゲルを足場として用いた細胞培養系を確立した。さらに細胞ラッピングをより簡便に実行するための場としてリキッドマーブルを選択し、その内水相での生化学反応とハイドロゲル化反応の同時進行が可能なこと、内水相での細胞培養が可能なことを確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに得られた成果に立脚し、異次元細胞集塊からなる異種細胞複合構造の形成を試みる。シート状細胞構造体形成に対しては、最適化されたチオール化ゼラチンとヘパリンからなるハイブリッドゲルを有効に活用し、ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC細胞からなる細胞シートによりヒト肝癌由来HepG2細胞からなるスフェロイドをラッピングすることで、スフェロイド機能が向上することを確認する。この時、ヘパリンによる多様な増殖因子の捕捉が、最終的に得られる高次の細胞集塊の高機能化に与える影響を検証する。さらに、本研究で確立された概念をリキッドマーブルの系へと展開する。特に、その内水相のハイドロゲル化と連動させることで、マーブルの中で形成されたスフェロイドを、マーブルを覆った細胞シートでラッピングする系へと展開することを試みる。このようにして、本研究の成果をよりハンドリングの容易な細胞ラッピング系へと展開し、本概念の一般化と社会実装を目指した検討を通して、３次元組織構造形成に対する新たな選択肢を提案することを最終目標とする。
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| Causes of Carryover |
これまでの検討において、新規細胞包括法を開発するための細胞源に関する情報や、共包括材の一部の提供を受けながら、当初計画の改善・効率化により直接経費を節約することができ、当初目標の概念実証が可能な系であることを確認できた。本成果の価値を更に高め、国内外の学会や論文等で発表するための再現性の確認と、実用に資する汎用性を検討するのに必要となる試薬類を購入する。また、学会発表のための旅費、論文発表のための英文校正費用として使用する。
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