2017 Fiscal Year Research-status Report
圧力駆動Liver-on-a-chipの開発：三次元肝組織の生体外長期灌流培養
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17K19018
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
杉浦 慎治 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 創薬基盤研究部門, 上級主任研究員 (10399496)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | 組織工学 / 細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
三次元組織を圧力勾配場に配置して培養するために、多孔性膜を組み込んだ圧力駆動循環培養型マイクロ流体デバイスを製作した。フォトリソグラフィーとレプリカモールディング法を用いてマイクロ流体デバイスを加工した。流量測定により、デバイスが当初の設計通りに加工できていることを確認した。
肝実質細胞と血管内皮細胞によって構成される三次元組織を圧力駆動型マイクロ流体デバイス内に構築するためのモデルとして、ヒト肝癌由来細胞HepG2 とヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を共培養した。多孔性膜の上にHepG2 とHUVEC を所定の比率（1:1～10:1 程度）で混合し、面積あたり106～107cells/cm2 の細胞を導入した。この細胞密度は一般の単層培養の細胞密度の10～100倍程度の密度であり、重層三次元組織が形成される。マイクロ流体デバイスを加圧装置に接続することで形成された三次元組織を圧力勾配場に配置し、培養液を循環させて培養することが可能であることを確認した。
形成された三次元組織の機能評価を行ったところ、CYP3A4活性に対する共培養効果は認められなかったものの、3次元培養装置では通常の単層培養に比べ培養面積あたり70倍に相当する細胞が、その活性を保ったまま非常に狭い培養空間で培養できる事が確認された。また3次元共培養の組織構造は、3次元HepG2単独培養と比べその組織構造が密になっていた。しかしながら、培地内の成長因子などの濃度勾配が形成されなかったためか、血管様構造は観察されなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画に沿って研究を進め、特許出願及び学会発表に至るデータを取得することができたため、初年度の研究としては概ね順調に伸展していると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、血管網を配備した三次元肝組織の構築・成熟課程について検討を進める。具体的には、形成された三次元組織に１日から数日間培養液を循環培養することで三次元組織内の血管構造が成熟させる。血管組織を成熟させる条件に関しては様々な培養条件を最適化
する必要があると考えられるが、申請者がこれまでに検討してきた血管内皮細胞の培養条件等を参考にしつつ培養条件を最適化していく。培養条件のパラメーターとしては、細胞の混合比、配置、培養液の流量、膜のコーティング、培養液の組成などが考えられるが、血管内皮細胞の管腔構造の形成を指標として各パラメーターの影響を順次検討する。血管内皮細胞による管腔構造の形成を可視化するために、緑色蛍光タンパク質を発現するHUVEC を用い、共焦点レーザー顕微鏡で定期的に三次元蛍光観察する。同時に、血管組織の成熟
過程を評価するために、循環培養において三次元肝組織を透過する培地流量を定期的に測定する。また、所定のタイミングでLive/Dead アッセイを行い、三次元組織全体の細胞の生存率を評価する。
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| Causes of Carryover |
年度の後半に所属する研究所の運営費交付金が当初の予想を超えた金額で配分され、本事業の推進に利用することができた。このため、消耗品予算の支出が少なくなったため、次年度使用額が生じた。次年度使用額はそのまま次年度の消耗品予算に充て、当初の計画を超えた研究推進を目指す。
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