2017 Fiscal Year Research-status Report
ナノキュベットを用いたタンパク質の液中・動的・高分解能電子顕微鏡イメージング
| Project/Area Number |
17K19025
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
|---|
Principal Investigator |
三宮 工 東京工業大学, 物質理工学院, 准教授 (60610152)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
|
| Keywords | 電子顕微鏡 / 表面・界面物性 / ナノ材料 / その場観察 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では透過型電子顕微鏡用の水溶液中その場観察プラットフォームである「ナノキュベット」を開発し、バイオ応用を目指すものである。この手法では、水溶液層を非常に薄く保つことができるため、電子線の散乱をおおさえることができ、高い空間分解能で液中観察をすることができる。ここでは特に膜タンパクのイメージングを目指す。
H29年度には、１）液中観察プラットフォームであるナノキュベットの構造最適化、２）光学測定による閉じ込め状態の確認、３）走査型透過電子顕微鏡法の整備を行った。
１）ナノキュベットの作製には、コロイダルリソグラフィーを用いた。この手法では、キュベット膜を大面積で作製可能である。また、キュベット径、深さ、分布を容易に制御可能である。これまでにプラズモニック共鳴を持つキュベットの作製に成功している。今回、基礎的な光学特性を明らかにするために、分布を非常に大きくとった単一のキュベットの作製にも成功した。
２）試料作製および測定の再現性を確保するために、光測定によりキュベットに閉じ込められた液体の状態や、シーリング膜の密着性の見積もる手法を開発した。電子顕微鏡観察前に、光測定により簡便にサンプル状態確認ができれば、スループットの向上にもつながる。今回は基板上に作製したナノホール内に液体を閉じ込め、マクロ測定からキュベット内部及び周辺の温度・真空度依存性を測定した。
３）電子顕微鏡法の整備として、STEMによりタンパク質のような軽い元素がコントラスト良く測定できるかを確認した。低加速電圧にすることで、HAADFおよびBFを用いて、カーボンキュベットのエッジがコントラスト良く観察することができた。また、光導入機構のシステム作りに着手した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度に行う予定であった、１）液中観察プラットフォームであるナノキュベットの構造最適化、２）光学測定による閉じ込め状態の確認、３）走査型透過電子顕微鏡法の整備を、ほぼ予定どおり行うことができた。１）のナノキュベットの大面積作製方法はほぼ確立されたが、材料の最適化は、測定対象や測定法にあわせ、今後も進めていく必要がある。２）については、光学センシング可能なプラズモニック材料を用いたナノホール膜をセンチメートルサイズの基板上に作製し、真空引き中・加熱中のその場光学測定を行った。表面プラズモン共鳴は周囲の屈折率に敏感であることから、共鳴波長をモニタすることで閉じ込めた液体の状態をその場測定可能である。真空度、温度を変化させながら、液体の状態変化を観察した。真空引きの際に、試料によっては、信号が変化していく場合があることが分かった。これは、１）のサンプル作製の際に、閉じ込めた液体が抜ける可能性を示唆している。これは、おそらく、シーリング膜の「浮き」が発生していることに対応するため、シーリング膜をより薄く作製する必要があることを意味する。この知見はこの先の研究の重要な指針となる。
試料作製に関しては、タンパク導入の手法確認も先取りして一部行いはじめている。平成29年度中に試料作製が予定よりも早く進んだ分、平成30年度実施予定していた装置整備の一部を前倒しで実施することができた。具体的には、冷却ホルダの作製を開始し、光導入のための光学系の構築の一部を前倒し実施済である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度は、１）STEM法によるダメージ低減の確認、２）冷却の実現、３）タンパク質の観察、４）光導入光学系の整備を行っていく。
１）STEM法によるダメージ低減に関して、STEM法の整備はすでに着手しており、今後はサンプルのダメージを確認しながら最適な電流値やスキャン粗さを見極めていく必要がある。早いスキャンを重ねるほうが、試料ダメージが少ないという報告もありスキャンの調整を行う。
２）のサンプル冷却に関しては、電子線照射による試料温度上昇や物質拡散を避けるというのがメインの理由である。これまでに観察されている「泡」の生成や、ブラウン運動の抑制が期待できる。冷却ホルダの作製はH29年度に開始している。真空が引けることはすでに確認しており、H30年度はホルダ先端の試料保持部分をデザインし、冷却観察可能にする。試料保持部分は、STEM-CL装置の対物レンズギャップに設置された放物面ミラーのスリットを通過するため、十分な薄さが必要である。一方で、冷却のための熱伝導が必要なため、導電部分は太いほうが効率がよいので、試料の安定性を含め、適切にデザインする。材料としては加工、硬さに優れ、熱伝導性もよいリン青銅を用いる予定である。
３）のタンパク観察に関しては、比較的大きい分子であるIgGを用いて観察を行う。
４）の光学系導入では、レーザー及び、白色光導入の光学系を構築する。既存のCL測定機能を損なうことなく、光導入系を追加するために、光路にスライダーに乗せたハーフミラーを導入する。放物面鏡への光導入位置および角度の調整により、電子線照射位置と導入光照射位置を一致させる。これらの調整可能な素子（レンズ・ステージ・フィルター）を調整しながら必要に応じて導入していく。白色光を用いる場合には透過スペクトルの同時測定も可能なため、その場屈折率センシングも可能となる。
|
| Causes of Carryover |
当初は冷却ホルダの新規導入を予定していたが、今回行った予備実験により、譲渡寄付されたホルダの改造で実験が可能な目途が立ったため、H30年度に改造費として後ろ倒し予定である。また、試料作製部分の結果が想定よりはやく出たため、後ろ倒し予算の一部を学会発表予定で学会参加費・旅費に充てる予定である。さらに、30年度に構築予定の光導入光学系にも後ろ倒しした予算の一部を充てる。具体的には、光導入系の光学部品およびSTEMスキャン制御のためのシステム改造費である。
|
Research Products
(9 results)
