2018 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
17K19028
|
|---|
| Research Institution | Shinshu University |
|---|
Principal Investigator |
秋山 佳丈 信州大学, 学術研究院繊維学系, 准教授 (80585878)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
|
| Keywords | 超瞬間凍結 / 凍結保存 / 低温生物学 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，インクジェット技術による微小液滴を利用し超瞬間的に凍結することで，凍結保護剤フリーの凍結保存手法を確立することを目指している．H29年度に得られた結果を踏まえて，H30年度は以下の項目について研究を行った．
・冷却速度の算出．本手法により凍結された細胞がガラス化されているかを，冷却速度より評価した．インクジェットによる液滴は非常に小さいため，直接の温度計測は困難である．そこで，非常有限要素法に基づく伝熱解析によりインクジェットにより液体窒素で冷却された基板に吐出された液滴の冷却速度を算出し，細胞のガラス化に必要な臨界冷却速度（毎秒10,000 K）と比較した．まず，200 pLの液滴で150マイクロメートル厚のガラス基板の場合，冷却速度は，毎秒7,000 K強と臨界冷却速度を下回った．一方，40 pLの液滴の場合は同ガラス基板において毎秒22,000 Kと臨界冷却速度を上回った．さらに，冷却速度をさらに高めるために極薄ガラス基板（5 マイクロメートル厚）としたところ、毎秒37,000 Kにまで達した．この結果は，昨年度の得られた結果，液滴サイズを40 pLとすることで3T3細胞の生存率が急上昇したことと一致する．
・他の細胞への応用．超瞬間凍結保存法を，マウス筋芽細胞株C2C12および初代ラット間葉系幹細胞へと応用した．その結果，細胞の生存率は，従来法（DMSOを用いた緩慢凍結法）と同等であった．さらに，間葉系幹細胞において，凍結解凍後も未分化マーカー（CD73およびCD146）が維持されていることを確認した．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画にあったシミュレーションによる冷却速度だけでなく，解凍速度も含めて行うことが出来た．そして，一般的な細胞株だけでなく，間葉系幹細胞へも適用可能であることを実証することができた．
|
| Strategy for Future Research Activity |
超瞬間凍結保存法における問題点である脱ガラス化を防ぐ手法を検討するとともに，本手法の血球，精子，微生物等への適用可能性についても検討する．
|
| Causes of Carryover |
本年度，凍結液滴のガラス化評価のために顕微ラマン分光装置を購入予定であった．しかし，学部共通機器により必要な実験を行うことができることが確認できた一方で，超瞬間凍結保存において保存期間中の生存率維持には脱ガラス化を防ぐ必要があり，そのための装置を開発する必要が出てきた．そこで，繰り越した経費により，脱ガラス化を防ぐために超瞬間凍結装置の改良を行う．
|
