2017 Fiscal Year Research-status Report
Rheo-NMRによるアミロイド線維化機構の解明と新規Rheo-NMR装置の開発
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17K19196
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
菅瀬 謙治 京都大学, 工学研究科, 准教授 (00300822)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2019-03-31
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| Keywords | NMR / レオロジー / タンパク質 / アミロイド線維 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、αシヌクレインのリアルタイムRheo-NMR測定、SOD1のリアルタイムRheo-NMR測定、剪断力存在下におけるダイユビキチンのダイナミクス解析を行った。αシヌクレインのリアルタイムRheo-NMR測定では、これまでヘキサユビキチンとSOD1の場合では観測できなかったラグタイムが見られ、シグモイド関数様に減少した。SOD1のリアルタイムRheo-NMR測定では、NMRシグナル減衰曲線に対して指数関数でフィッティングを試みたところ、フィットせず、シグナル強度の減衰速度が時間経過とともに速くなっていることが分かった。15N横緩和速度R2も剪断力をかけている時間経過とともに速くなることが分かった。加えて、Rheo-NMR測定後の試料を動的光散乱で計測したところ、分子量の大きいオリゴマーが検出された。このオリゴマーのNMRシグナルは、リアルタイムRheo-NMRでは観測できなかったが、それはオリゴマーの分子量が大きすぎるためであると考えられる。一般にR2は分子間相互作用があると速くなることから、SOD1は線維化過程においてオリゴマーと相互作用することが示唆された。
ダイユビキチンのダイナミクス解析では、K48架橋型ダイユビキチンのピコ秒－ナノ秒およびマイクロ秒の運動性の解析を静置状態と撹拌状態で行った。その結果、両タイムスケールともdistal側のユビキチンユニットだけにダイナミクスの変化が見られた。とくにイソペプチド結合を形成するdistal側のC末端領域に大きな変化が見られた。
また、モーター駆動式のRheo-NMR二号機の開発を進め、まずはNMRマグネットの外で同様な機構で剪断力をかけられるコエットセルを完成させた。このコエットセルのモーター部分と5mmφNMR管と3mmφガラス棒を固定する部品は、製作中のRheo-NMR2号機二全く同じものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
Rheo-NMR二号機の開発がとくに計画以上に進んでいる。コエットセルのモーター部分と5mmφNMR管と3mmφガラス棒を固定する部品は、製作中のRheo-NMR2号機と全く同じものであるため、あとはモーターと3mmφガラス棒を繋ぐドライブシャフト、およびモーターをNMRマグネット直上に固定する部品を作ればRheo-NMR２号機が完成する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、リアルタイムRheo-NMR実験から、αシヌクレインの場合はシグモイド曲線様の強度変化のプロファイルを、SOD1の場合は指数関数様のプロファイルを得ている。両者ともに速度論的なモデルを構築し、フィッティングを行う。
また【現在までの進捗状況】で記述したように、Rheo-NMR２号機を完成させる。
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| Causes of Carryover |
計画していた装置開発にかかる費用が安く済んだ。この次年度使用額は本年度の装置開発の費用に使用する予定である。
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