2017 Fiscal Year Research-status Report
A new genetic tool for translational regulation in mammalian cells
| Project/Area Number |
17K19200
|
|---|
| Research Institution | Kyoto University |
|---|
Principal Investigator |
佐藤 慎一 京都大学, 化学研究所, 准教授 (70534478)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2019-03-31
|
| Keywords | リボスイッチ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
細胞の恒常性は，核酸・タンパク質・脂質・糖鎖・代謝産物などの生体分子が互いに連携・機能することで維持されている．細胞機能の理解を深めるためには，これら生体分子の時空間的な発現量を系統立てて研究することが重要であろう．本研究では，細胞機能を担う主役生体分子の一つであるタンパク質の精密な発現制御を可能とする生物学研究ツールの開発を目的とする．
具体的な研究の計画として次の２点に焦点を絞って研究を遂行した。研究計画として以下の２点に焦点を絞って研究を遂行する．
計画① Split-IRESリボスイッチの設計とタンパク質発現制御能を評価する．
計画② Split-IRESリボスイッチの利用により細胞機能を制御する．
計画①に関しては、無細胞タンパク質翻訳システムにおいて、動物細胞発現系を設計したリボスイッチを利用することでタンパク質発現の誘導・抑制を厳密に制御することに成功した．該当年度の成果として、このリボスイッチを更に設計・高機能化することで、実験計画書に示したDualスイッチとして機能させることに成功した．研究は次の段階に入っており、計画②に示した、作製したリボスイッチを利用した細胞機能の制御を目指して研究を遂行中である．予備検討として、計画①で作製したリボスイッチをヒトHeLa細胞に導入し、そのタンパク質発現誘導能を評価したが、利用したPSIV-IRES構造の動物細胞内のタンパク質発現開始活性が良くないという問題があることが分かった．そこで、PSIV-IRESに代わるIRES構造を10種作製し、それぞれのヒト細胞内タンパク質発現誘導活性を比較したところ、PSIV-IRESの約1000倍の活性を示すIAPV-IRESを見い出し、IAPV-IRESにsplit-IRESリボスイッチ活性を付加できることを確認した．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要にも記したが、研究計画書に示した無細胞タンパク質翻訳システムにおいて、動物細胞発現系を設計したリボスイッチを利用することでタンパク質発現の誘導・抑制を厳密に制御することに成功した．更に、このリボスイッチを高機能化することで、実験計画書に示したDualスイッチとして機能させることに成功した．研究の次段階である、作製したリボスイッチによる細胞機能の制御に関して、予備検討として、作製したリボスイッチのヒトHeLa細胞内でのタンパク質発現誘導能を評価したところ、利用したPSIV-IRES構造のヒト細胞内のタンパク質発現開始活性が良くないという問題があることが分かった．そこで、PSIV-IRESに代わるIRES構造を探索したところ、PSIV-IRESの約1000倍の活性を示すIAPV-IRESを見い出し、IAPV-IRESにsplit-IRESリボスイッチ活性を付加できることを確認した．
|
| Strategy for Future Research Activity |
研究計画書に示した具体的な目的と計画は次の２点である．
① Split-IRESリボスイッチの設計とタンパク質発現制御能を評価する．
② Split-IRESリボスイッチの利用により細胞機能を制御する．
目的①に関しては、ほぼ目的を達成している。目的②に関しては、当初予期していなかった問題が生じたが、初年度にこの問題点を克服できたので、計画書通り、ヒト細胞内でのタンパク質発現の精密制御を目指す．これまでに、動物細胞内で高い性能で機能する人工リボスイッチは報告されたことがなく、本研究の成功は、新たな核酸設計の指針にも成り得る．高いインパクトの論文への公表が期待できるだろう．
|
