2017 Fiscal Year Research-status Report
Development of site-specific labeling method of single-transmembrane receptors
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17K19206
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
禾 晃和 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 准教授 (40379102)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2019-03-31
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| Keywords | 1回膜貫通型受容体 / 半合成 / 受容体活性化機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、1回膜貫通型の細胞表面受容体である上皮成長因子受容体（Epidermal growth factor receptor; EGFR）の活性化機構を解明するために、細胞外領域断片に対して、標識を導入した膜貫通ペプチドを連結する実験系の構築に取り組んだ。連結反応によって出来上がる半合成受容体分子を用いて、活性化時に膜上で起きる受容体の構造変化を検出することを最終的な目的として研究に取り組んだ。細胞外領域断片の発現には、浮遊系の培養細胞を用いた。細胞外領域には多数の糖鎖が付加されることから、培養時にマンノシダーゼの阻害剤であるキフネンシンを添加することで糖鎖構造を均一化させた。可溶性断片として培地中に分泌された細胞外領域断片は、代表者らが独自に開発したPAタグを用いてアフィニティー精製した。精製試料には、細胞外領域断片が多量体化した成分も含まれていたことから、ゲルろ過クロマトグラフィーによって単量体成分を抽出した。本年度の研究では、最終目標である膜貫通ペプチドとの反応を行う前に、抗体エピトープを含む可溶性のペプチドを用いて反応条件の検討を行った。その結果、反応を効率的に進行させるためには、低濃度の還元剤の添加が必要であることが明らかになった。また、可溶性のモデルペプチドとの連結反応の検討と並行して、最終的に連結反応を行う対象である膜貫通ペプチドの調製と脂質二重層への再構成の条件検討も開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
モデルペプチドとの反応条件については最適化が進展しており、次年度に膜貫通ペプチドと反応させるための準備が進んだことから、概ね順調であると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
還元剤の添加後も細胞外領域の構造が保持されているかを検証しつつ、膜貫通ペプチドとの反応条件の検討を進める。これまでは反応の進行度を主に電気泳動によって調べていたが、質量分析なども取り入れることで、ジスルフィド結合がどのような状態にあるかなど、反応産物の状態をより詳細に調べて行く。また、最終的には、膜貫通ペプチドを脂質二重層環境に再構成する必要があることから、バイセルやナノディスクなどのディスク膜にペプチドを導入する条件を確立していきたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
当初は還元剤の添加なしに反応が進行するものと予想して研究を開始したが、実際には還元剤の添加が必要であること判明し、研究計画全体の練り直しが必要となったことから、次年度使用額が生じた。次年度の研究では、膜貫通ペプチドの脂質二重層への再構成に取り組むことから、生じた次年度使用額で脂質等の試薬を購入したいと考えている。また、研究をさらに効率的に進めるために研究補助員を雇用する予定であり、当該助成金を人件費に当てたいと考えている。
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Research Products
(11 results)
