人工光受容体によるアブシジン酸シグナルの局所的且つ局時的制御

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K19226
• Research Institution: Shizuoka University
• Principal Investigator: 竹内 純 静岡大学, 農学部, 助教 (00776320)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2020-03-31
• Keywords: 植物 / 有機化学 / 生理活性

Outline of Annual Research Achievements

アブシジン酸（ABA）は受容体（PYL）と結合時に，PYLの配座を不活性型から活性型に変化させる。活性型配座のPYLはABAシグナル伝達の正の制御因子SnRK2を負の制御因子PP2Cから開放することによってABAシグナル伝達をONにする。本研究では，PYLの配座変化がABAシグナル伝達のON/OFFと連動している点に着目し，光異性化による立体構造変化と連動してPYLの配座を活性型/不活性型にする化合物を創出し，高い時間・空間分解能でABAシグナル伝達を解析する新たな実験手法の開発に取り組んでいる。本年度は先ず，異なる波長の光でE/Z互変異性化するアゾベンゼンをABAの環部分に導入したLICAP（LIght-activated Covalently-linked Agonist of PYL）/iLICAP（LICAPのantagonist型）の設計，合成方法の確立に取り組んだ。PYLアゴニストとして報告されているtetralone ABAをリード化合物として，芳香環の先にアゾベンゼンを導入した化合物（LICAP）をデザインし，6-amino-1-tetraloneからの合成方法を検討した。現在までに，アゾベンゼンおよびABAの側鎖部分を導入した合成中間体のまでの合成方法を確立した。また，合成中間体を用いて予備的な光異性化実験を行い，365 nmの光照射によってアゾベンゼンのE→Z異性化が数秒で速やかに進行することを確認した。今後は，LICAP/iLICAPの合成を進めると共に，in vitro試験により合成した化合物の光スイッチ機能を検証する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の合成スキームでは，6-amino-1-tetraloneのアミノ基を保護した後，ABA側鎖部分をはじめとするPYLアゴニストとして必須の官能基を導入し，最後に保護基を外してアゾベンゼンを導入する予定であったが，アミノ基の保護反応がなかなか上手くいかなかった（収率の低さ等）ため，予想外に時間を取られてしまった。保護基の種類や反応条件を複数検討したが，上記問題を解決することが出来なかったため，最終的には合成スキームを見直してアゾベンゼンを最初に導入することで中間体までの合成方法を確立した。一方，アゾベンゼンの光異性化に関しては，平成30年度以降に，光照射によるiLICAP（E型）からLICAP（Z型）への異性化条件，およびLICAPの暗所下でのiLICAPへの異性化速度を検討する予定でいたが，本年度，合成中間体を用いて一部検討した。その結果，導入したアゾベンゼンのE→Z異性化はTLC用のハンディランプを用いた光照射においても数秒で速やかに進行し，Z型は暗所下で徐々にE型に戻っていくものの，24時間の時点では約40%がZ型であることを確認した。しかし，本年度は最終化合物までの合成には至らず，学会等で研究成果発表を行うことが出来なかったことを踏まえて進捗状況を総合的に判断すると，研究はやや遅れていると評価した。

Strategy for Future Research Activity

昨年度に引き続きLICAP/iLICAPの合成を進める。PYL受容体のリガンド結合ポケットに存在するLys残基側鎖とSciff塩基を介して共有結合可能なアルデヒド基をABA側鎖末端に導入し，その後，アルデヒド基を光分解性保護基で保護したcaged inactive LICAP（c-iLICAP）の合成を行う。アルデヒド基の光分解性保護基については，LuらおよびHagenらの開発したクマリン類縁体で修飾されたアセタールを用いる。この保護基は365 nmで迅速に（速度定数10-9 s-1）分解することが報告されており，加えて，この波長の光はアゾベンゼンのE→Z異性化を促進することも確認している。そのため，ケージ解除と光異性化によるiLICAPからLICAPへの生成を同時に効率よく実現できると考えている。次に，合成したLICAP/iLICAPを用いて，LICAPの暗所下でのiLICAPへの異性化速度，および光照射によるiLICAPへの異性化条件を検討する。
また，in vitroで光スイッチ機能を検証する。大腸菌発現系により調製したPYLとPP2CにLICAP/iLICAPを加えて光照射を行い，PYLの活性制御およびPYLとの共有結合形成について調べる。モデル植物であるシロイヌナズナには14種類のPYLサブタイプが存在するため，先ず手始めにPYR1とPYL5を用い，PP2Cに関してはHAB1を用いる（これらの組合せで良好な結果が得られたら，他のサブタイプについても検討する）。具体的には，in vitro PP2C活性試験により，光照射によってアゴニスト/アンタゴニスト活性の転換が起こるかどうかを検証する。