2017 Fiscal Year Research-status Report
Mechanism of liquid-air phase-dependent differentiation in cultured keratinocyte
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17K19228
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
人見 清隆 名古屋大学, 創薬科学研究科, 教授 (00202276)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | 表皮組織 / タンパク質架橋化酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
表皮細胞の培養系は長年開発利用されているが、実際の表皮組織を模倣できる培養系は限定された条件のみでなければ達成されない。すなわち、未分化な表皮細胞をカルシウム高濃度の培地で生育させ、空気暴露することが必須であることは、かねてより知られているものの、そのメカニズムは不明である。本研究ではこのメカニズムを解明すると同時に、表皮分化促進を行える因子をこの培養系の分化メカニズムを解明して進めたいとするものである。
まず、実際に自身が行おうとする立体培養系において、空気暴露を行うことでどの程度の表皮形成の遅れがみられるのか、の解析から開始した。表皮分化において空気暴露の有無における表皮形成の程度を、固定染色によって比較したところ、明確に最外層の形成が遅れた。そこから細胞抽出物を様々に解析できる十分量は回収できなかったが、その状態を観察することができた。そのため、これに加えて立体培養に関してのより効率的な方法を見出すために、種々の化学物質を添加しつつ、タンパク質架橋化酵素の活性や表皮構造タンパク質の発現パターンを指標にして検討した。
得られた抽出物を用いて、本年度の計画としてあげていた、培養時の空気暴露の有無で、タンパク質発現パターンの変動を検討した。表皮分化の鍵酵素となるタンパク質架橋化酵素について調べた。予想に反して、分化段階初期においてはあまり明確な変動がなく、初期段階では空気暴露がなくとも分化したが、成熟する最終分化には空気暴露は必要であった。その後の段階で違いが生まれることが判明した。
空気暴露が表皮の最終分化に必須であることを組織染色方法を用いて確認し、さらにタンパク質架橋化酵素の発現量について解析した。また、今後の解析のために、培養した表皮細胞からより大量にタンパク質を取得する目的で、細胞抽出の効率の良い培養方法についても検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
空気暴露のメカニズム解明は全く新規な分化誘導機構を追求するもので、参考にするような先行研究例はない。そのため、まず表皮立体培養方法の効率化を検討し、また実際に空気暴露の有無でどの程度の形成表皮の再現に差があるのかを調べた。その結果、明確な差を認め、今後遺伝子並びにタンパク質レベルで網羅的に解析する意義を認め、当初の計画を実施した。さらに、立体培養系でのメカニズム解明と並行し、促進因子の探索もめざした。次年度より予定した促進因子の検索については具体的には進めていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
実際に表皮細胞形成において、用いる系で空気暴露が分化に必要であることを確認し、タンパク質抽出液を解析してその差異を明らかにできたので、今後は、タンパク質およびそれ以外の分子種も含めて、質量分析も活用して発現されている分子群の違いを詳細に検討したい。
また、この培養系の分化能を決定するのがどの段階（日数）なのかを明らかにし、タンパク質抽出液をより十分量得て、マーカーとなる分化特異的タンパク質について種々発現解析したい。また、空気暴露の有無での培養細胞からmRNAを取得し、発現されている遺伝子群(DNAマイクロアレイなどによる)網羅的な発現遺伝子群の差異の比較、へと展開したい。
また詳細を記すこと避けるが、様々な組織や分子を対象にして、空気暴露がなくとも分化促進が行える細胞生育環境、因子の探索を行う。
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| Causes of Carryover |
当初行う予定で会った培養実験が、次年度にまとめて培養容器と培地の入手を遅らせて行うこととしたため、持ち越した。なるべく速やかに実施予定であり、使用を予定している。
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