2017 Fiscal Year Research-status Report
Development of a regulatory system of membrane potential in plant using microbial rhodopsin
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17K19230
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| Research Institution | Nagoya Institute of Technology |
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Principal Investigator |
井上 雅恵 (今野雅恵) 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 研究員 (60459732)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | 植物培養細胞 / 遺伝子導入 / 微生物型ロドプシン / 膜電位 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、微生物型ロドプシンの光駆動イオン輸送能を利用し、植物の細胞膜電位を光で制御する系を確立することを目的としている。計画初年度の平成29年度は、主に植物培養細胞系の構築を行った。微生物型ロドプシン遺伝子を導入する植物培養細胞として、Arabidopsis thaliana由来T87株の培養系を新しく導入し、安定して継代できる培養系を構築した。また、遺伝子の一過的導入を確認するためのコントロールとして、CaMV 35SプロモーターでEGFPの発現誘導を行うベクターを作製し、T87株への一過的遺伝子導入を確認した。しかし、現在のところ形質転換効率が1割程度と低いため、膜電位制御分子のスクリーニングの効率を上げるため、遺伝子導入方法の再検討を行っている。
今後膜電位制御に用いる微生物型ロドプシン分子として、外向きプロトンポンプ、外向きナトリウムポンプ、内向きクロライドポンプ、カチオンチャネル、アニオンチャネルを考えてきたが、我々はこれまで報告されてきた分子とは構造上の特性が異なる新規カチオンチャネルGtCCR4を海洋性クリプト藻Guillardia thetaから単離した。この分子のイオン輸送や光反応に関する特性を解析した結果をBiophysics and Physicobiology誌に報告した（第二著者）。GtCCR4は、動物細胞でのイオン輸送測定結果から、イオン輸送能や光による不活性化の点で、これまで最も広く用いられているクラミドモナス由来チャネルロドプシンChR2よりも光遺伝学に有用であることが示されている。さらに、GtCCR4は極大吸収波長が536nmで、植物の内生光受容体の極大吸収波長と重複しない。この事は、本研究での植物細胞の膜電位制御においてもGtCCR4は重要な候補分子であることを示す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
植物培養細胞の培養系を立ち上げ、蛍光タンパク質を用いた一過的タンパク質発現についても確認することができた。当初考えていた膜電位制御分子のスクリーニング法は、膜電位指示薬を用いて、蛍光変化を検出する方法であるため、この方法を適用するには、なるべく目的タンパク質の導入効率を上げる必要がある。しかし、現状では導入したタンパク質発現の効率は、1割程度にとどまっており、このままでは膜電位変化の検出は困難であると考えられる。
一方で、我々は海洋性藻類から新たな光依存カチオンチャネルを発見した。我々のグループは、この分子が膜電位制御に非常に有用な性質を持っていることを動物細胞の系では既に確認しており、植物細胞に適用するにあたっても非常に有望な分子であると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
低い遺伝子導入効率に関する問題を解決するため、今後、一過的発現の条件検討、およびアグロバクテリウム法を用いた遺伝子導入について検討する。植物細胞の膜電位制御に用いる微生物型ロドプシンの候補遺伝子は既に入手済みであるので、35Sプロモーターによりタンパク質を発現させ、膜電位を制御できる候補遺伝子のスクリーニングを行う。膜発現については蛍光顕微鏡観察、膜電位変化に関しては膜電位指示薬を用いて行う。有望な分子については、パッチクランプ法を用いて膜電位制御の詳細についても解析を行う。
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| Causes of Carryover |
旅費の使用額が予定より少なかったため、差額が生じた。本年度の物品費は主に消耗品費に使う予定である。また、カナダで開かれる国際学会への参加を予定しているため、学会参加費として使用する。
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