2017 Fiscal Year Research-status Report
卵黄タンパク質置換型高効率タンパク質発現システムの開発
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17K19236
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
渡辺 肇 大阪大学, 工学研究科, 教授 (80212322)
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2017-06-30 – 2019-03-31
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| Keywords | ミジンコ / 組換えタンパク質 / 緑色蛍光タンパク質 / CRISPR/Cas9 / トランスジェニック |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、遺伝子工学的手法を用いて卵黄タンパク質を有用タンパク質と入れ替え、卵内に有用タンパク質を蓄積させるシステムの開発を目的とする。対象生物としては飼育と繁殖が迅速かつ簡便に行えるミジンコを用いる。ミジンコは微小なものの高密度で飼育できることから、卵黄タンパク質を有用タンパク質と置き換えることができれば容易に大量の目的タンパク質を得られる。エサは炭酸固定としても注目されている緑藻を用いることから、「炭酸固定をしながら水から有用タンパク質を作る」ことが可能になる。
（１） 我々はすでに幼若ホルモン応答 DNA 配列を有するプロモーターが、ミジンコの脂肪体特異的な発現することを見出している。そこでこのプロモーターの下流に分泌シグナルペプチドと GFP を融合させた「分泌型 GFP 融合遺伝子」を挿入したプラスミドを作製した。
（２） この作製したプラスミド DNA を一過的に卵に導入し、融合遺伝子産物の局在を蛍光顕微鏡で観察する。並行してマイクロキャピラリーを用いてヘモリンフを採取し、蛍光の測定およびウエスタン法などで、実際にヘモリンフ中に分泌される融合タンパク質を確認した。
（３）この「分泌型 GFP 融合遺伝子」にさらにビテロジェニン受容体と相互作用するドメインを融合させ、 「ビテロジェニン受容体結合 GFP 遺伝子」を作製した。
（４） 作製した「ビテロジェニン受容体結合 GFP 融合遺伝子」をミジンコ卵に顕微注入し、その発現を確認した。一過的な解析においては、融合遺伝子を注入後、約１週間培養をつづけ、育房に産み付けられた卵を回収し、蛍光顕微鏡でマーカーとしている GFP タンパク質の卵への蓄積を確認することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ミジンコのビテロジェニン遺伝子から、ビテロジェニン受容体結合領域を同定することができ、この領域を融合させたGFPタンパク質は、実際に血中をとおり卵中に蓄積させることが確認できた。これは目的タンパク質を卵中に輸送するために必須の知見であったが、これを検証できたことで、研究の進捗はおおむね順調に進展していると判断できる。
今後は、この遺伝子を含むトランスジェニック系統を樹立すること、またビテロジェニン遺伝子と作製したキメラ遺伝子を置換することにより、研究目的を達成できる可能性がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度までに機能することが確認できた「ビテロジェニン受容体結合型GFP遺伝子」をCRISPR/Cas9 を用いてビテロジェニン遺伝子の下流に挿入する。
また実際にビテロジェニン遺伝子を組換えタンパク質産生遺伝子と置換するために、下記の一連の研究を行う。
（１）「ビテロジェニン受容体結合型 GFP 遺伝子」をもつトランスジェニック系統を用い、ビテロジェニン遺伝子の両端にｌｏｘＰ配列を挿入する。挿入に際してはCRSPR/Cas9 を用いる。 （２） （１）の loxP の系統と並行して Cre リコンビナーゼ発現系を作製する。ヒートショック遺伝子の制御領域下に Cre リコンビナーゼ遺伝子を導入したトランスジェニックミジンコを作製する。（３） （１）の loxP 系統および（２）の Cre 系統を掛け合わせ Cre-loxP が機能する系統を作製する。ミジンコは通常単為生殖で増殖するためメスしか存在しないが、ミジンコを幼若ホルモン処理することでオスを作ることができ交配が可能になる。この系統を用いて実際にヒートショック処理をすることにより、「ビテロジェニン受容体結合型 GFP 遺伝子」が卵黄遺伝子のかわりに卵内に蓄積されることを確認する。ミジンコは通常単為生殖をするが、我々はすでに幼若ホルモン処理によりオスを産生させ交配する技術を確立している(Tatarazako et al. Chemosphere 2003)。この技術を用いて、強制的にオスを産生させ交配させることにより、掛け合わせた系統を作製する。 （４） 実際に作製した HSP70A(プロモーター)-Cre 遺伝子 と「ビテロジェニン受容体結合型 GFP遺伝子」をもつ系統を用いて、ヒートショックにより卵内に GFP 遺伝子産物が蓄積されることを確認する。
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