2017 Fiscal Year Research-status Report

Development of characteristic control system of plants by faint electricity

Research Project

Project/Area Number	17K19241
Research Institution	The University of Tokushima
Principal Investigator	小暮健太朗徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学系), 教授 (70262540)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	田中保徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学系), 准教授 (90258301) 福田達也徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学系), 助教 (90805160)
Project Period (FY)	2017-06-30 – 2019-03-31
Keywords	微弱電流処理 / 植物 / 遺伝子発現制御
Outline of Annual Research Achievements	研究代表者は、微弱電流処理による動物細胞への薬物送達に関する実績に基づき、「微弱電流処理による植物細胞の生理機能変化を利用すれば、siRNAおよびプラスミドDNA等の核酸を非侵襲的かつ効率的に細胞質へ送達可能であり、ウイルスなどを用いずとも形質を制御できるのではないか」、という仮説を立てた。従って、本研究の目的は、本仮説を検証し、微弱電流処理による植物の成長と形質の制御システムを開発することである。すなわち、「水耕栽培系においてsiRNAやプラスミドDNA等を水溶液中に共存させることで植物の形質を転換することができるか検証すること」を本研究の目的としている。具体的には、シロイヌナズナ水耕栽培システム（Araponics system）を用いシロイヌナズナをある程度まで成長させた後、蛍光標識化オリゴDNAを含有する溶液中で、ヒト心電図検査用電極シートを用いて微弱電流処理を行い、根茎部切片を共焦点レーザー顕微鏡により観察することで、根茎細胞内への蛍光標識オリゴDNAの評価に挑戦した。動物細胞同様に、OCTコンパウンドを用いて凍結切片を作成したが、根茎の自家蛍光もあり、観察が困難であった。植物組織の透明化手法を用い、観察に妨げとなる色素を除去した状態での観察も試みたが、リグニンによる緑色自家蛍光が観察され、蛍光標識オリゴDNAの蛍光と重なるため、正確な観察に影響があることが確認された。そこで、蛍光色素をリグニンの蛍光と重複しないものに変更し、シロイヌナズナの根茎部の微弱電流処理を実施し共焦点レーザー顕微鏡観察を検討しているところである。微弱電流処理による植物組織へのダメージに関して、共焦点レーザー顕微鏡観察がうまく行えていないため、アポトーシス誘導の有無までは確かめていないが、これまで観察してきた印象では、大きなダメージは起こっていないのではないかと考えている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 動物細胞同様に、OCTコンパウンドを用いて凍結切片を作成したが、根茎の自家蛍光もあり、観察が困難であった。植物組織の透明化手法を用い、観察に妨げとなる色素を除去した状態での観察も試みたが、リグニンによる緑色自家蛍光が観察され、蛍光標識オリゴDNAの蛍光と重なるため、正確な観察に影響があることが確認された。このように、根茎部内への蛍光標識オリゴDNAの送達の可否が判断に時間を要しているため、当初計画よりもやや遅れていると判断した。
Strategy for Future Research Activity	リグニンと異なる蛍光波長を有する蛍光標識オリゴDNAを用い、シロイヌナズナの根茎部を微弱電流処理することで、根茎部細胞内へのオリゴDNAの送達を確認できると考えている。この観察が達成されれば、初年度予定していた、微弱電流処理による根茎部への核酸送達、および微弱電流処理条件の最適化、微弱電流処理による植物組織へのダメージ（アポトーシス誘導）の評価を直ちに達成可能であると考えている。さらに、本年度実施予定である標的遺伝子mRNAの発現抑制の評価にも挑戦可能であると考えている。
Causes of Carryover	年度末に発注した物品の納品が、年度中に間に合わなかったため、年度内に支払いが完了せず、経理システム上残額が数千円生じることになったため、次年度使用額が0より大きくなった。今年度は、そのようなことにならないよう、年度内に支払いが完了するように、研究計画に基づいた具体的な使用計画を立てて研究を遂行する。