Development of a non-GM method for crop genome editing

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K19249
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 今井 亮三 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 主席研究員 (90291913)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2019-03-31
• Keywords: コムギ / CRISPR / ジベレリン / RNP

Outline of Annual Research Achievements

当初計画では，ジベレリン生合成に関与するent-coparyl diphosphate synthase 1（CPS1）とGA20 oxidase (sd1)をターゲットとした変異導入をCas9遺伝子及び gRNA遺伝子を金粒子にコートし，iPB法によりコムギ茎頂に導入する予定であった．しかし，他のプロジェクトにおける研究進展から，金粒子を用いてRNPを直接茎頂組織に導入する手法が確立されたので，今年度は，次年度以降に検討する予定であった，RNP直接導入による変異創出を前倒しで行った．まず，コムギsd1遺伝子配列からターゲット配列をCRISPRdirectソフトウエアを利用してデザインした．gRNAはin vitro転写により合成し，大腸菌から精製されたCas9タンパク質と共に，金粒子に吸着させ，パーティクルガンにより茎頂組織に導入した．金粒子導入胚より植物体を成長させ，T0個体の止葉においてゲノムDNAを抽出し，CAPS解析を行った．これまでにボンバードメントを行った143胚あたり，8個体（6%）において変異が検出された．塩基配列解析から，これらのうち１個体においては，A,B,Dゲノム全てのsd1遺伝子において，変異が導入されていることが明らかとなった．CPS1遺伝子についてもsd1遺伝子同様の手法で変異導入を試みたが，A,B,D全てのゲノムに変異が検出されるような個体は得られなかった．

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

初年度において，CRISPR/Cas9 RNP直接導入法により，T0植物体において遺伝子変異導入に成功したことから，予定より早い進行と言える．

Strategy for Future Research Activity

sd1遺伝子変異体について，T1世代における変異の遺伝について解析を進めると共に，新たな変異体の創出を行う．A,B,D全ゲノム遺伝子について変異が固定された個体を表現型解析を行う．

Causes of Carryover

大筋で研究は計画以上の進度であるが，CPS1変異体の解析等，次年度へ繰り越される実験があったため．
次年度において繰り越された実験を行う．