An approach toward developing embryogenic stem cells in rice for transgene-free genome editing

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K19255
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 鳥山 欽哉 東北大学, 農学研究科, 教授 (20183882)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2019-03-31
• Keywords: 育種学 / 遺伝学 / ゲノム / バイオテクノロジー / 植物

Outline of Annual Research Achievements

ゲノム編集技術ではCRISPR/Cas9などの部位特異的なヌクレアーゼを用いて標的遺伝子を自在に改変することが可能ある。マウスやゼブラフィッシュなどでは、卵細胞にCas9（DNA切断酵素）タンパク質とガイドRNAの複合体(RNP)を導入することで、標的遺伝子改変が可能となる。組換えDNA分子が宿主ゲノムに組み込まれることはない（DNAフリー）。
本研究では、イネの培養細胞を動物のES細胞（Embryonic Stem Cell）に見立て、動物の卵細胞と同じ実験を行えるのではないかと考えた。イネの細胞培養にアミノ酸培地（AA培地）を用いて、細かくバラバラになりやすいサスペンジョンセルを得た。培養細胞の直径は10～15μmであった。これより細いマイクロインジェクションピペットを検討した結果、とKITAZATO社製、Micro Tools for ICSI Injection（カタログ番号7100）が適していた。しかし、マイクロマニピュレーターに不具合があったこともあり、RNPの導入実験までには至らなかった。次に、イネのサスペンジョンセルのモデルとなっているOc細胞に対して、パーティクルガン法を用いて、RNPを導入し、ゲノム編集の有無を調査した。しかし、ゲノム編集を確認することはできなかった。サスペンジョンセルを用いた実験では、植物体を再生させるに至っていない。より簡便に植物体を再生させるために、催芽種子の茎頂分裂組織(SAM)にRNPの導入することとした。GFPをコードするDNAの導入が可能かどうかを調査した結果、露出させたSAMにおいて、 GFPの蛍光を示す種子を観察することができた。これより、 茎頂分裂組織にRNPを導入した方が、簡便にDNAフリーのゲノム編集植物を得ることができると期待された。