葉緑体への核酸運搬ペプチドを用いた巨大遺伝子導入法の開発

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K19278
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 吉積 毅 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 上級研究員 (80342872)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2020-03-31
• Keywords: 巨大DNA / 遺伝子送達 / 葉緑体 / ペプチド / 形質転換 / ゲノム

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、巨大遺伝子を葉緑体に導入する技術の開発を目的とする。この目的に向かって本年度は以下2つの課題を設定した。
1）葉緑体ゲノムを組み換えるための準巨大プラスミドの作成
枯草菌と大腸菌のシャトルベクターであるpLSBAC101’ (80 kbp)に、葉緑体ゲノムへの組込みに必要な相同配列と、GFPとスペクチノマイシン耐性遺伝子が融合したレポーター遺伝子を挿入する計画を設定していた。pLSBAC101’はサイズが大きいため、ユニークな制限酵素配列がない。そのため、枯草菌内で相同組換えにより、上記配列を挿入する。平成29年度は、上記配列の挿入に必要なコンストラクトを作製した。しかし、最終産物（葉緑体ゲノムへの組込可能なpLSBAC101’）の作成には至っていない。
2)物性の検証
pLSBAC101’とペプチド複合体の物性と試験管内における物理的保護効果について検証を行った。動的光散乱法を用いて、pLSBAC101’とペプチド複合体の粒径を測定すると共に、原子間力顕微鏡による形状を観察した。次に、この複合体に対して、卓上破砕機（チューブに激しい振動を与える）を用いて物理的剪断処理を与える事で生じるプラスミド断片化の度合いを定量化した。ペプチドとの複合体を形成した場合には、50 %プラスミドが超らせん構造を維持していた。一方、プラスミドのみでは超らせん構造は完全に消失していた。これら結果から、ペプチドは80 kbpの準巨大DNAを内包した複合体を形成することで、物理的剪断から保護することが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

pLSBAC101’に目的の配列（葉緑体ゲノムの一部と相同の配列、融合レポーター遺伝子）を挿入するためのコンストラクト作りに時間を費やした。この理由として、コンストラクトの複雑さが挙げられる。作成したコンストラクトを、pLSBAC101’を持つ枯草菌内に導入し、相同組換えにより挿入を行う。そのため、コンストラクトには上記配列に加えて、pLSBAC101’と相同な配列と枯草菌の選抜に必要な抗生物質耐性遺伝子を組込む必要があった。コンストラクトは平成29年度末に完成したため、枯草菌内でのpLABAC101’への上記コンストラクト組み込みはまだ一度しか試していない。

Strategy for Future Research Activity

H30年では葉緑体ゲノムへ組込む装置を格納したpLSBAC101’(pLSBAC101’Cp, 85 kbp)の作成を優先的に行う。pLSBAC101’とペプチドの複合体形成と物理的剪断からの保護の検証は完了しているため、ペプチドを用いてこのプラスミドをタバコへ導入する。導入が確認できた場合、枯草菌ゲノムにクローニングされたイネ葉緑体ゲノムをpLSBAC101’に移し換える。イネ葉緑体を格納したpLSBAC101’Cpは約215 kbpとなる。この巨大プラスミドとペプチドの物性を検証すると共に、タバコ葉緑体への導入を試みる。

Causes of Carryover

研究室で保有していた試薬等で、平成29年度の研究はすべて実施できたため。加えて、予定していた出張が、材料調整が遅れたため次年度に計画を変更した。