2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of novel biomineral formation technology by genome modification of mantle outer epithelial cells in pearl oyster
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17K19282
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
木下 滋晴 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (40401179)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柿沼 誠 三重大学, 生物資源学研究科, 教授 (60303757)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2019-03-31
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| Keywords | アコヤガイ / Pinctada fucata / バイオミネラリゼーション / ゲノム改変 / ゲノム編集 / トランスジェニック |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アコヤガイへの遺伝子導入については、引き続き、アコヤガイから外套膜縁膜部を採取し、酵素処理により外面上皮細胞を分離した。導入する遺伝子として、CMVプロモーターの下流に赤色蛍光タンパク質であるDsRed配列を有するpDsRed-Max-N1ベクターおよび、in vitro転写により合成したgreen fluorescent protein（GFP）mRNAを用いた。導入方法としてエレクトロポレーション法、リポフェクション法、および磁性粒子とリポフェクション法を組み合わせた方法の3つを検討した。その結果、DsRedによる赤色蛍光は、いずれの方法および条件でも確認できなかったが、GFPの緑色蛍光はエレクトロポレーション法によりmRNAの導入を試みた細胞で確認することができた。ただし、導入効率は極めて低く、アコヤガイ由来プロモーターの導入など、さらに検討が必要である。
また、ナクレイン、Pifおよびtyrosinase遺伝子をターゲットとしたゲノム編集を試みた。in vitro転写にてgRNAを作成し、Cas9タンパク質と共に、アコヤガイ閉殻筋に注入後、数日して各組織を採取し、ターゲット領域を含む100-300bpをPCRで増幅した。増副産物はHMAにより変異の導入を検出すると共に、サンガーシーケンシングにより変異を確認した。その結果、ナクレインについては、HMAによるバンドのシフトおよびシーケンスによる欠損変異を検出した。さらに検証が必要であるが、アコヤガイでのゲノム編集としては前例がなく、アコヤガイの基礎研究およびアコヤガイを用いた新規バイオミネラル形成の技術基盤となる成果と考える。
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