Quick development of disease-model microminiature pig by RNA-guided gene drive

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K19326
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 小野 悦郎 九州大学, 医学研究院, 教授 (00160903)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大竹 正剛 静岡県畜産技術研究所, 中小家畜研究センター 養豚・養鶏, 上席研究員 (90605677)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2019-03-31
• Keywords: Gene drive / マイクロミニピッグ / Msh2遺伝子 / リンチ症候群 / ゲノム編集

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、RNA-guided gene driveを用いたマイクロミニピッグ（MMP）のgene drive方法を確立し、効率の良い疾患モデルMMPの作製方法を開発する。その第一弾として、Msh2遺伝子を欠損させたリンチ症候群MMPを開発することを目的とする。
1. Gene drive用DNAカセットの挿入部位は、Msh2遺伝子のExon 1とし、これをPCRで増幅し、DSB-HDRアッセイ（Assayfor DSB mediated HDR by EGFP reconstitution）用レポータープラスミドを構築した。次に、CRISPR directにより標的配列を決定し、CRISPR /Cas9ベクターであるpX459に20mer標的配列に基づくオリゴヌクレオチドを挿入し、標的DNA切断プラスミドを構築した。構築した2種類のプラスミドを用いて、DSB-HDRアッセイを実施し、Msh2遺伝子のDNA配列が切断されることを確認した。
2. sgRNA発現用DNAと生殖系列特異的にCas9を発現させるVASA-Cas9融合DNAをタンデムに結合させ、Msh2遺伝子の切断部位の5’側および3’側の各々約2KbのDNA断片で挿み、gene drive用プラスミドを構築した。
3. 構築したgene drive用プラスミドをMMPの胎仔線維芽細胞（PEF）に導入し、3種類のゲノム編集Msh2遺伝子ノックアウトPEFを樹立することに成功した。これらの細胞株を用いて、今後、体細胞クローン胚を作製、移植することでMsh2遺伝子ノックアウトMMPを作出する予定である。
4. 合成sgRNA、Cas9蛋白質およびgene drive用プラスミドをマイクロインジェクションにより、MMPの受精卵前核に注入後、仮親ブタに移植し、妊娠を確認した。今後、ゲノム編集MMPの誕生が期待される。