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2017 Fiscal Year Research-status Report

蛍光性非天然アミノリン脂質合成酵素の創出

Research Project

Project/Area Number 17K19338
Research InstitutionYamagata University

Principal Investigator

田村 康  山形大学, 理学部, 准教授 (50631876)

Project Period (FY) 2017-06-30 – 2019-03-31
Keywords人工酵素 / リン脂質 / 出芽酵母
Outline of Annual Research Achievements

本研究では大腸菌のホスファチジルセリン(PS)合成酵素PssAを改変し,本来の基質であるセリンの代わりに蛍光性基を導入したセリンを認識する酵素の創出を目指している。今年度はまず,大腸菌にランダム変異を導入したPssA遺伝子を持つ発現プラスミドを導入し,変異PssA発現大腸菌ライブラリーを作製した。この大腸菌ライブラリーをコロニーピッカーを利用して384プレートに植菌し,蛍光性セリンを脂質に取り込むPssA変異体のスクリーニングを開始した。具体的には384本のチップを同時に操作できるマルチピペッターを用いて,384プレート上で蛍光性セリンが脂質画分に取り込まれているかを調べた。しかし現在のところ,384プレート上での脂質抽出操作が想定していたよりも技術的に難しく,蛍光性セリンを基質として認識するPssA変異体の単離には至っていない。
一方,PssAを酵母細胞内の様々な区画に発現させ,酵母のPS合成酵素(Cho1)の欠損を相補できるかを確認したところ,小胞体に発現させたPssA以外にも,ペルオキシソームや脂肪滴に標的化させたPssAが,Cho1の欠損を相補できることを見出した。これら結果から,出芽酵母細胞を変異PssA発現ライブラリーとして用いることを着想し,現在は酵母細胞を用いたスクリーニング実験系の構築を行っている。具体的には酵母の変異PssA発現ライブラリーを蛍光性セリンを加えた培地で培養する。この細胞集団を洗浄後セルソーターにかけて,蛍光強度が高い細胞集団を選別し濃縮していく。この作業を繰り返すことで蛍光性セリンを基質として認識できるように改変されたPssA変異体が単離できると期待される。大腸菌を用いた場合ではコロニー一つ一つを扱わなければならなかったが,この方法では数百万個の細胞を一気に選別できるため,スクリーニングの効率も飛躍的に高まることが期待される。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

大腸菌のホスファチジルセリン(PS)合成酵素PssAを改変し,蛍光性セリンを認識する人工酵素を創出するために,今年度は大腸菌を用いて,変異PssAライブラリーを作製し,スクリーニングを行った。しかしながら,384プレート上での脂質抽出操作が想定していたよりも技術的に難しかったため,スクリーニング実験が順調に進行しなかった。しかしその一方で,出芽酵母細胞を用いたスクリーニング実験系を着想し,研究の方向転換を行うこととなった。出芽酵母細胞を用いることにより,大腸菌の場合には必要であったIPTG添加によるPssAの発現誘導の作業が不要になったことや,セルソーターによる細胞集団のソーティングが可能になり,細胞から脂質を抽出する作業も不要になったことから,スクリーニングの効率が飛躍的に上昇することが予想される。大腸菌を用いていた場合は,コロニー一つ一つを個別にピックして384プレート上で扱わなければならなかったのに対し,セルソーターを用いる方法では,数百万個の細胞を一気に選別できるため,スクリーニングの効率も飛躍的に高まることが期待される。実際に出芽酵母細胞にGFP融合タンパク質を発現させて,所有するセルソーターでGFP蛍光を基準に細胞をソーティング出来るかを確認することが出来た。この結果より,変異PssAの発現に依存して,蛍光性セリンを細胞内に蓄積する細胞集団をソーティング,濃縮することで,順調にスクリーニングが進展すると考えられることから,おおむね順調に進展しているとした。

Strategy for Future Research Activity

今後は,蛍光性セリン存在下で培養した変異PssA発現酵母細胞ライブラリーをセルソーターを用い,蛍光性セリンを細胞内に蓄積した細胞集団をソーティング,濃縮する。蛍光シグナルを指標に濃縮した集団を顕微鏡下で観察し,実際にサイボの膜構造が蛍光ラベルされているかを検討する。その後細胞からプラスミドDNAを回収し,PssAの配列をシーケンスすることで,蛍光性セリンを基質として認識できる人工酵素の単離を目指す。

Causes of Carryover

当初予定していた大腸菌によるスクリーニングを中断したために,見込んでいた384本セットになっているチップカセットの購入などを取りやめた。翌年度に出芽酵母細胞をセルソーターで分離する新たな実験を行うために,セルソーターに関する消耗品などに使用する。

  • Research Products

    (17 results)

All 2018 2017 Other

All Journal Article (4 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results) Presentation (12 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 4 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle-targeted split-GFP system2018

    • Author(s)
      Kakimoto Yuriko、Tashiro Shinya、Kojima Rieko、Morozumi Yuki、Endo Toshiya、Tamura Yasushi
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 8 Pages: 6175~6175

    • DOI

      10.1038/s41598-018-24466-0

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Shuttle mission in the mitochondrial intermembrane space2018

    • Author(s)
      Endo Toshiya、Tamura Yasushi
    • Journal Title

      The EMBO Journal

      Volume: 37 Pages: e98993~e98993

    • DOI

      10.15252/embj.201898993

    • Open Access
  • [Journal Article] Structure?function insights into direct lipid transfer between membranes by Mmm1?Mdm12 of ERMES2017

    • Author(s)
      Kawano Shin、Tamura Yasushi、Kojima Rieko、Bala Siqin、Asai Eri、Michel Agn?s H.、Kornmann Beno?t、Riezman Isabelle、Riezman Howard、Sakae Yoshitake、Okamoto Yuko、Endo Toshiya
    • Journal Title

      The Journal of Cell Biology

      Volume: 217 Pages: 959~974

    • DOI

      10.1083/jcb.201704119

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Role of intra- and inter-mitochondrial membrane contact sites in yeast phospholipid biogenesis2017

    • Author(s)
      Tamura Y. and Endo T.
    • Journal Title

      Advances in Experimental Medicine and Biology

      Volume: 997 Pages: 121-133

    • DOI

      10.1007/978-981-10-4567-7_9

  • [Presentation] Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle-targeted split-GFP probes2018

    • Author(s)
      Yasushi Tamura
    • Organizer
      1st International Mitochondria Meeting for Young Scientists
    • Invited
  • [Presentation] 大阪大学蛋白質研究所セミナー・再構成アプローチが開拓する生体膜・ 膜タンパク質研究の最前線2018

    • Author(s)
      田村 康
    • Organizer
      オルガネラ間リン脂質輸送反応の 再構成実験系
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 出芽酵母における ミトコンドリア・小胞体連携ゾーンの役割2017

    • Author(s)
      田村 康
    • Organizer
      2017年度生命科学系学会合同年次大会 ConBio2017
    • Invited
  • [Presentation] Structural and Mechanistic Insights into Phospholipid Transfer via Mitochondria2017

    • Author(s)
      Yasushi Tamura
    • Organizer
      Smasys 2017 (5th International Conference on Smart Systems Engineering 2017)
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Split GFP を用いたオルガネラ膜間近接評価実験系の確立2017

    • Author(s)
      柿元百合子,遠藤斗志也,田村康
    • Organizer
      第69回日本細胞生物学会
  • [Presentation] ミトコンドリア外膜へのミスターゲットした膜タンパク質の分解機構の解析2017

    • Author(s)
      松本俊介,中務邦雄,田村康,江崎雅俊,遠藤斗志也
    • Organizer
      2017年度生命科学系学会合同年次大会 ConBio2017
  • [Presentation] カルジオリピン量の維持には正常なクリステ構造が必要である2017

    • Author(s)
      小島理恵子,伊藤喜重,瀬崎博美,遠藤斗志也,田村康
    • Organizer
      2017年度生命科学系学会合同年次大会 ConBio2017
  • [Presentation] 小胞体膜タンパク質Ilm1の欠損はリン脂質輸送とスフィンゴ脂質異常を引き起こす2017

    • Author(s)
      古田詩唯奈,小島理恵子,遠藤斗志也,田村康
    • Organizer
      2017年度生命科学系学会合同年次大会 ConBio2017
  • [Presentation] 基本転写因子TFIIEの構造生物学的研究2017

    • Author(s)
      帯田孝之,三輪康平,小島理恵子,大熊芳明,田村康,水口峰之
    • Organizer
      2017年度生命科学系学会合同年次大会 ConBio2017
  • [Presentation] ミトコンドリアポリンタンパク質Por1は外膜透過装置TOM複合体のアセンブリー調節因子として機能する2017

    • Author(s)
      阪上春香,石坂直也,塩田拓也,田村康,遠藤斗志也
    • Organizer
      2017年度生命科学系学会合同年次大会 ConBio2017
  • [Presentation] Split-GFPを用いたオルガネラ膜間テザリング因子の探索2017

    • Author(s)
      柿本百合子,遠藤斗志也,田村康
    • Organizer
      2017年度生命科学系学会合同年次大会 ConBio2017
  • [Presentation] タンパク質膜挿入反応に関与する糖脂質酵素MPIaseは生育に必須である2017

    • Author(s)
      沢里 克宏,佐藤 諒,西川 華子,飯村 直樹,藤川 鉱樹,山口 敏幸,車 ゆうてつ,田村 康,遠藤 斗志也,上田 卓也,島本 啓子,西山 賢一
    • Organizer
      2017年度生命科学系学会合同年次大会 ConBio2017
  • [Remarks]

    • URL

      https://www.tamuralab.com/

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Published: 2018-12-17   Modified: 2023-03-20  

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