2018 Fiscal Year Annual Research Report
Creation of fluorescent unnatural aminophospholipid synthases
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17K19338
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
田村 康 山形大学, 理学部, 准教授 (50631876)
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2017-06-30 – 2019-03-31
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| Keywords | リン脂質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，大腸菌ホスファチジルセリン（PS）合成酵素PssAを改変し，蛍光ラベルセリンを基質として認識することができる人工酵素を開発することで，細胞内で蛍光PSを合成できる細胞を創出することである。ランダム変異導入したPssAを発現する大腸菌ライブラリーを作製し，スクリーニング実験を行ったが，蛍光性非天然アミノ酸を認識する酵素の選別が難しく，目的の人工酵素を単離することはできなかった。
一方，出芽酵母細胞のPS合成酵素の代わりに，出芽酵母細胞の様々なオルガネラ膜にPssAを発現する変異細胞を作製し，その増殖，リン脂質組成，PS合成活性などを調べたところ，興味深いことに本来のPSの合成の場である小胞体以外のオルガネラ，具体的には脂肪滴，ペルオキシソーム，ミトコンドリア内膜でPSを合成しても細胞の増殖に充分量のPSを合成できることを明らかにした。また様々な細胞内区画で合成されたPSが効率よくミトコンドリア内膜の酵素によってPEに変換されることから，脂肪滴，ペルオキシソーム，ミトコンドリア内膜間で効率よくリン脂質の輸送反応が起きていることがわかった。これらの結果は，細胞内リン脂質の輸送経路を明らかにする上で重要な発見であり，現在論文にまとめているところである。
蛍光PSを合成できる改変PssAを合成するためには，遺伝学するクリーニングを用いる方保は難しかったため，PssAの立体構造を明らかにし，基質との結合部位を決定することにした。これまでにPssAを大腸菌から大量発現，精製し，結晶化できる条件まで決定することができた。今後，基質との共結晶の作成を進め，X線構造解析により構造決定を行う予定である。
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