2018 Fiscal Year Research-status Report

ミトコンドリアを持たない真核細胞研究のキックオフ

Research Project

Project/Area Number	17K19340
Research Institution	Saitama University
Principal Investigator	高橋康弘埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (10154874)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中井由実大阪医科大学, 医学部, 講師 (80268193)
Project Period (FY)	2017-06-30 – 2020-03-31
Keywords	ミトコンドリア / 鉄硫黄クラスター / 生合成
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、モデル真核生物である出芽酵母の鉄硫黄（Fe-S）クラスター生合成系を改変することで、酵母ミトコンドリアにおける唯一の必須機能をバイパスさせ、“ミトコンドリアを持たない真核細胞”をはじめて実験的に創り出すことを最終的な目標としている。H30年度は、バクテリアのFe-Sクラスター生合成系であるNIFマシナリーの２成分（NifSとNifU）を酵母の細胞質で発現させ、CIAマシナリーと協調してクラスターを生合成できるように改変することを目指して、以下の研究を進めた。 NifSとNifUについて構造機能解析を進め、Fe-Sクラスター生合成系としての特性を検討した。NifSの活性部位の柔軟な触媒ループの構造はこれまで不明であったが、種々の条件を検討し、この触媒ループを含めた反応中間体の構造決定にはじめて成功した。これによって、NifSの触媒反応で重要となる反応中間体と活性部位のアミノ酸との相互作用や、複雑に絡み合った触媒ループが反応時に解消されるべきトポロジー変化を見出した。バクテリアのNifSとNifUを酵母の細胞質で発現させ、Western解析によって確認した。また、NifS、NifUの発現が出芽酵母の生育に影響を及ぼさないことを確認した。次に、相同組換えによってミトコンドリア内のFe-Sクラスター生合成に関与する遺伝子ATM1やNFS1の遺伝子破壊を試みた。ATM1遺伝子の破壊には成功したものの、この破壊株はNifS、NifU発現プラスミドを脱落させても生育可能であった。ATM1は必須遺伝子と報告されていたが、NifS、NifUの有無に関係なく破壊されたことから、Fe-Sクラスター生合成系の改変において、指標にはならないことが判明した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason NIFマシナリーの構造と機能について解析を進め、作動機構の詳細に迫りつつある。一方、NIFマシナリーを発現させた酵母でATM1を破壊することができたものの、予想に反して、NIFマシナリーの発現とは関係が無いことが判明した。また、NFS1の破壊株は得られていないため、今後、種々の条件を検討する必要がある。
Strategy for Future Research Activity	NIFマシナリーを細胞質で発現させることによって、ミトコンドリアISCマシナリーの必須機能（細胞質や核のFe-Sタンパク質のクラスター形成）がバイパスできるかどうか、以下の方法で検討する。 1. 酵母のNFS1は必須遺伝子だが、そのプロモーターをガラクトースプロモーターにすげ替えたGal-NFS1発現制御株が構築されている。この株にNifS、NifU発現プラスミドを導入し、培地のガラクトースをグルコースに置換することによってNfs1を枯渇させ、その影響を調べる。 2. NIFマシナリーは酸素に対して感受性が高いという性質が知られている。そこで、酵母に導入したNIFマシナリーを十分に機能させられるように嫌気的な発酵条件で生育させ、NFS1破壊株のスクリーニングを進める。 3. NFS1に加えて、ミトコンドリア内ISCマシナリーの別の必須成分（JAC1）の遺伝子破壊を試みる。
Causes of Carryover	必須遺伝子と報告されていた、酵母ATM1遺伝子の破壊株が想定外の性質を示したため、予定していた実験を延長して慎重に検討した。そのため、残金が発生した。今後、NFS1やJAC1といった必須遺伝子の破壊では、さらなる困難さが予想されるため、破壊株の構築に必要な合成オリゴDNAやクローニングに必要なキット・試薬の購入、また種々の培養条件を検討するため費用にあてる計画である。