2019 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
17K19340
|
|---|
| Research Institution | Saitama University |
|---|
Principal Investigator |
高橋 康弘 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (10154874)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中井 由実 大阪医科大学, 医学部, 講師 (80268193)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2021-03-31
|
| Keywords | 鉄硫黄クラスター |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
真核細胞では、ミトコンドリアに局在するISCマシナリーとサイトゾルに局在するCIAマシナリーが協調して、鉄硫黄（Fe-S）クラスターを生合成している。本研究では、モデル真核生物である出芽酵母のFe-Sクラスター生合成系を操作することで、酵母ミトコンドリアにおける唯一の必須機能（ISCマシナリーによるFe-Sクラスター生合成）バイパスさせ、“ミトコンドリアを持たない真核細胞”をはじめて実験的に創り出すことを最終的な目標としている。R1年度は、バクテリアのFe-Sクラスター生合成系であるNIFマシナリーの２成分（NifSとNifU）を酵母のサイトゾルで発現させ、CIAマシナリーと協調してクラスターを生合成できるように改変することを目指して、以下の研究を進めた。
酵母のサイトゾルに導入したバクテリア由来のNIFマシナリーによって、ミトコンドリアにおける唯一の必須機能（ISCマシナリーによるFe-Sクラスター生合成）をバイパスすることができるかどうか、ISCマシナリーの必須成分（JAC1とNFS1）の遺伝子破壊を試みることで検討した。その結果、必須遺伝子であるJAC1の破壊に（世界で初めて）成功し、破壊株の表現型から、ミトコンドリア内のFe-Sタンパク質群（TCA回路や電子伝達系）は機能していないが、サイトゾルや核のFe-Sタンパク質群は正常と推定された（予想通り）。ただし、別の必須遺伝子であるNFS1の破壊株は得らなかったため、その原因について検討を重ねた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ISCマシナリーの必須成分のひとつJAC1の遺伝子破壊に成功したことから、このアプローチは大きく前進したと判断できる。ただし、別の必須遺伝子であるNFS1の破壊株は得られていないため、今後、新たなアプローチを検討する必要がある。
|
| Strategy for Future Research Activity |
1.JAC1破壊株は嫌気条件でのみゆっくりと生育するが、そこから、好気条件での生育が回復したリバータントを単離した。このリバータントでは、サイトゾルにおけるFe-Sクラスターの生合成能（NIFマシナリーとCIAマシナリーとの協調性）が改善した可能性が高いため、種々のFe-S酵素の活性を比較することで回復の程度を検討する。
2.サイトゾルにおけるFe-Sクラスター生合成能が回復していれば、このリバータントのゲノム解析を行い、変異部位を特定する。また、このリバータントをホストとしてNFS1の破壊、さらにはミトコンドリア膜の透過装置をコードする必須遺伝子の破壊を試みる。
|
| Causes of Carryover |
ISCマシナリーの必須成分をコードする遺伝子のうち、JAC1は破壊できたがNFS1は破壊できないという想定外の現象に遭遇し、予定を延長して慎重に検討を行ったため残金が発生した。R2年度に、破壊株の構築に必要な合成オリゴDNAやクローニングに必要なキット・試薬の購入、また種々の培養条件を検討するための費用にあてる計画である。なお、当初想定した年度内では研究が完了できないため、期間を延長して成果につなげたい。
|
