2018 Fiscal Year Research-status Report
変異体を用いた新規合成脂質スクリーニングが解き明かす光合成膜脂質の機能
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17K19342
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
小林 康一 大阪府立大学, 高等教育推進機構, 准教授 (40587945)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安部 真人 愛媛大学, 農学研究科, 准教授 (30543425)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | 脂質 / シアノバクテリア / ホスファチジルグリセロール / 光合成 / 膜 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体膜を構成する極性脂質には数千を超える分子種が存在するが、生物がこれほどまでに多様な脂質分子を利用する意義は未だに不明である。本研究では、シアノバクテリアが外部から脂質分子を容易に取り込む性質を利用し、化学的に合成した多種多様な脂質分子種を脂質合成変異体に取り込ませ、生体内の膜脂質構成を人為的に改変する。その時、様々な機能や生理活性を発揮する脂質分子のケミカルスクリーニングを行うことで、これまで予想もされなかった脂質分子の新規機能の発見と解明を目指す。本研究では特に、光合成に必須の役割を担うホスファチジルグリセロール（PG）を解析のターゲットとする。
研究は2つのグループにより2段階において行っている。第一段階は安部グループによるリン脂質全合成法を用いたPG類の人工合成であり、第二段階が小林グループによる合成されたPGを用いたシアノバクテリア内での生理活性テストやPGと光合成複合体との相互作用解析である。これまで、安部グループによる化学合成の結果、PGの脂肪酸の炭素鎖長を12から20まで改変し、二重結合の位置や数も様々に変更した分子種を得ることができ、これらの脂肪酸をグリセロール骨格にエーテル結合で導入することにより、内在の酵素による脂肪酸の置換を防ぐことに成功した。また、PGと性質の近いカルジオリピンにおいても、多様な分子種を合成することに成功している。小林グループが進める研究では、光合成反応中心タンパク質と特定のPGとの相互作用が光化学系IIの複合体形成に重要であることや、PGと同じ酸性脂質であるSQDGで置き換えられる機能と置き換えられない機能をPGがもつことが分かってきた。さらに、脂質の極性頭部だけでなく、疎水性尾部の長さや二重結合の数がシアノバクテリアの生育に重要なことも明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究代表者の小林、分担者の安部ともに2018年度から新しい大学に異動した。それにより、本研究を進めるためにまずは研究室のセットアップや研究環境や分析系の立ち上げに注力する必要が生じたことから、当初想定したよりも研究の進捗が遅れた。しかし、安部グループによる合成脂質の供給体制が整い、小林グループでもシアノバクテリアの生育や各種の解析を行う体制が確立できた。また、シアノバクテリアの野生株での合成脂質投与の影響を調べるにあたって、単に栄養成長時に与えるだけではすでに合成されたPGと光化学系が十分働くため合成脂質投与の影響が見えづらい可能性が本研究により分かってきた。そこで2018年度は、光合成反応系が活発に構築されるタイミングでの合成PG投与の影響を調べる実験系を検討した。シアノバクテリアの細胞を窒素欠乏下で培養することによりいったん光合成反応系を減衰させ、その後窒素添加により光合成反応系が回復するタイミングで合成PGを与えることで、合成PGの光合成反応系への取り込みを促進させる手法を考案した。その予備実験として、共同研究により、窒素欠乏および復帰時のチラコイド膜脂質や光合成タンパク質、光合成色素の量の経時的な解析を行った結果、窒素欠乏後とそこからの復帰時に非常にダイナミックにこれらのチラコイド膜構成因子の量が変化することを突き止めることができた。それに加え、PGと相互作用するタンパク質のアミノ酸分子種を改変する手法から、特定のPG分子が反応中心タンパク質の特定のアミノ酸と総合作用することが光合成機能に重要であることも明らかにし、今後の合成PGの構造検討に向けた大きなヒントとなった。これらの結果は、2018年度の成果として大きく評価できる点である。
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| Strategy for Future Research Activity |
安部グループは引き続き、疎水性尾部や極性頭部を改変したPG類縁体の合成を進める。不飽和度の改変や、トランス脂肪酸や酸化・過酸化脂肪酸を導入したPG類の合成を行う。また、極性頭部における水酸基の除去やエーテル化、正電荷付加などによりその物理化学特性を改変したPG類の合成に取り組む。さらに、疎水性尾部と極性頭部の各種の組み合わせにより、膨大な組み合わせのPG類の合成が可能となるため、その効率的な合成方法の検討と検証を行い、大規模スクリーニングに向けた合成脂質ライブラリーの作成を進める。
小林グループは、各種合成PG類を取り込ませたシアノバクテリアPG合成欠損株の表現型解析を進める。また、野生株における合成PGの作用を評価するため、栄養飢餓復帰によるチラコイド膜構築過程における合成PG投与の影響を解析する。それに加え、PGの材料でもあるリンを欠乏した時のPGの合成量やチラコイド膜への影響、合成PG投与の効果も評価する。また、複数条件で並行してシアノバクテリアを培養する系の検討やイメージングによるハイスループットな生育の評価法を構築し、多様な脂質分子種による大規模スクリーニングの効率的な手法の確立を目指す。すでに生育に強い影響を与えることが分かってきている短鎖脂肪酸結合型PGに関しては、クロロフィル前駆体や誘導体の分析によるクロロフィル代謝への影響の評価や光合成解析を行い、そのメカニズムを分析する。また、今後の研究を見据え、シアノバクテリアだけでなく真核藻類における栄養欠乏時のPGの取り込みの評価も行う予定である。
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| Causes of Carryover |
新規研究室の立ち上げや実験系の再検討などにより大規模スクリーニングの実施に至ることができなかったため、本研究の最終目的である合成脂質のもつ生理活性の大規模スクリーニングの実施は次年度に持ち越すこととなった。安部グループによる合成脂質の供給体制が整い、小林グループでもシアノバクテリアの生育や各種の解析を行う体制が確立できたことから、次年度は、大規模ハイスループット解析の実施とPG類縁体を用いた個別解析を順次進めていく計画である。また栄養欠乏条件を用いたシアノバクテリアの生育条件も検討できたため、脂質合成の変異株だけでなく、野生株における合成脂質の生理活性評価も研究に取り入れる予定である。生理活性機能の大規模スクリーニングには、多検体の同時解析を可能にするイメージング技術やハイスループット分析が要となるため、それらの効率的な解析系の確立に繰り越した研究費を使用する予定である。
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