2018 Fiscal Year Research-status Report
G+C含量の異なる16S rRNA遺伝子をもつ好塩性アーキアの温度適応メカニズム
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17K19346
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| Research Institution | Shizuoka University |
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Principal Investigator |
木村 浩之 静岡大学, グリーン科学技術研究所, 教授 (30377717)
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2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | 温度適応 / 微生物 / 好塩菌 / リボソームRNA / G+C含量 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昼夜で激しく環境温度が変動する砂漠の塩湖に生息する好塩性アーキアは、ゲノム上に塩基配列が異なり、且つ、グアニンとシトシンの割合（G+C含量）が異なる複数種の16S rRNA遺伝子を有する。しかしながら、異なるG+C含量の16S rRNA遺伝子を有する生理生態学的な意義や重要性は明らかにされていない。これまでの研究において、原核生物の16S rRNA遺伝子のG+C含量と至適生育温度は非常に高い相関を示すことが報告されている。本研究課題では、好塩性アーキアは昼間の高温時には耐熱性を有する高いG+C含量の16S rRNAを含むリボソームを機能させ、夜から早朝にかけての低温時には転写効率のよい低いG+C含量の16S rRNAを含むリボソームを機能させるという仮説を検証した。そして、環境温度が激しく変動する極限環境に適応したアーキアが有する温度適応メカニズムを解明することを目的とした。
2018年度は、好塩性アーキア菌株を用いてリボソームRNAオペロンの欠損株を作製することに成功した。次に、幅広い生育温度にて好塩性アーキアの各欠損株および野生株を培養し、幅広い生育温度における増殖速度を測定した。そして、G+C含量の異なる16S rRNAを含む各リボソームの機能や重要性を示した。加えて、ゲノム解読済みの好塩性アーキアHaloarcula属菌株を最低生育温度に近い低温と最高生育温度に近い高温にて培養した。その後、全RNAを抽出し、cDNAを合成したのち、次世代シーケンサーを用いて網羅的にcDNAの塩基配列を決定した。そして、遺伝子の同定、リード数の解析を行い、各cDNAを比較した。その結果、温度センシングやリボソームRNAオペロンの転写制御に関与するいくつかの遺伝子群を見出すことに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2018年度は、好塩性アーキア菌株を用いてリボソームRNAオペロンの欠損株を作製した。本研究課題ではゲノム解読済みのHaloarcula属菌株を選定して、その野生株から高いG+C含量の16S r RNA遺伝子を含むリボソームRNAオペロンを欠損させた菌株と低いG+C含量の16S rRNA遺伝子を含むリボソームRNAオペロンを欠損させた菌株をそれぞれ作製した。各欠損株の作製には、リボソームRNAオペロンの前後約1,000 bpの塩基配列と薬剤耐性遺伝子を組み込んだプラスミドを作成し、これらのプラスミドを菌株に取り込ませた。その後、各リボソームRNAオペロンを薬剤耐性遺伝子に置換した。次に、遺伝子欠損株を生育温度内で5℃間隔にて培養し、各培養温度における欠損株の増殖速度および世代時間を算出するとともに、野生株の増殖速度と比較した。その結果、高いG+C含量を有する16S rRNA遺伝子のみを有する遺伝子欠損株は、低いG+C含量を有する16S rRNA遺伝子のみを有する遺伝子欠損株よりも、高温環境で有意に速い増殖を示した。
さらに、ゲノム解読済みの好塩性アーキアHaloarcula属菌株を最低生育温度に近い低温と最高生育温度に近い高温にて培養した。次に、遠心分離によって微生物細胞を集積したのち、これらの微生物細胞から全RNAを抽出し、cDNAを合成したのち、次世代シーケンサーを用いて網羅的にcDNAの塩基配列を決定した。その結果、温度センシングやリボソームRNAオペロンの転写制御に関与するいくつかの遺伝子群を特定した。一連の本研究結果を英語論文にまとめ、微生物学分野の国際学術雑誌に掲載した。以上のことから、本研究課題は、概ね順調に進んでいると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度は、低温と高温の培養条件下で好塩性アーキアをそれぞれ培養し、発現した全RNAを網羅的に解析する。そして、特に温度センシングおよびリボソームRNAオペロンの転写制御に関わるタンパク質酵素を遺伝子の発現レベルにて更なる解析を進める。特に、これまでに使用していないゲノム解読済みの好塩性アーキアHaloarcula属菌株を最低生育温度に近い低温と最高生育温度に近い高温にて培養する。次に、遠心分離によって微生物細胞を集積する。そして、微生物細胞からRNAを抽出したのち、逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。さらに、次世代シーケンサーを用いてcDNAの塩基配列を決定する。大量シーケンス解析用サーバーを用いて、遺伝子の同定、リード数のカウントを行い、低温と高温にて培養した各サンプルの遺伝子発現パターンを比較する。そして、温度センシンクグやリボソームRNAオペロンの転写制御に関与するタンパク酵素を明らかにする。
2019年度は本研究課題の最終年度であるため、研究成果を論文にまとめて国際学術雑誌に投稿する。さらに、一般向け科学雑誌、日本微生物生態学会第33回大会（山梨大）、静岡生命科学若手フォーラム主催の静岡ライフサイエンスシンポジウム（静岡大）、その他の国内外の微生物関連学会を通じて研究成果を発信する。
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| Causes of Carryover |
2018年度は好塩性アーキアの培養実験および網羅的RNA解析について一部実施したが、次世代シーケンサーを用いたRNA解析の完了には至らなかった。2019年度においては、残りの微生物培養実験および網羅的RNA解析を実施する計画であり、次世代シーケンサー解析費として使用する計画である。
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