2017 Fiscal Year Research-status Report
Electron crystallographic analysis of tomographic volumes of 2D crystals of membrane proteins
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17K19347
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
谷 一寿 名古屋大学, 細胞生理学研究センター, 特任教授 (20541204)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | クライオ電子顕微鏡 / 電子線結晶学 / クライオトモグラフィー / 二次元結晶 / F型ATPase / 負染色 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膜タンパク質の生理的機能を明らかにするうえで、天然に近い状態の立体構造を観察する意義は計り知れない。このような構造観察の手法としては、脂質二重膜中に再構成された膜タンパク質がシート状に整然と並ぶ二次元結晶を用いた電子線結晶解析は適しているが、たとえ結晶作製に成功しても分解能が悪いことも多く電子線結晶解析に適用できないものが多々ある。実際、我々がテストデータとして使用する結晶性の悪いウシ・ミトコンドリア由来のF型ATPaseの二次元結晶をクライオ電子顕微鏡で観察した場合、最も反射点の識別が容易な非傾斜像ですらフーリエ変換(ＦＦＴ)した際に観察できる反射点の指数付は難しく、傾斜させた実像のＦＦＴにいたっては反射点自体を認識することができなかったため、通常の電子線結晶学を適用することをあきらめざるを得なかった。本研究では、このような従来の解析方法では歯がたたなかった結晶性のよくない二次元結晶でも構造解析が行えるような方法を確立することを目標としている。
本申請の一連の解析アルゴリズムを確立するために、まずS/N比が高く電子線損傷に対して抵抗性の高い負染色を施したF型ATPase二次元結晶をテストデータとして、二次元結晶の傾斜シリーズデータを収集し、続いて通常のトモグラフィー法を適用して二次元結晶そのものの三次元再構成を得た。得られた再構成データ(voxel)のなかで結晶性が比較的良好な領域を三次元的に選択し、in sillicoの二次元結晶由来の投影像を作製し、電子線結晶学解析を適用することで、各反射点の振幅と位相を抽出しフーリエ合成を計算しマップを得ることができたため、構造解析アルゴリズムとしての可能性を示すことができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題は、電子線トモグラフィーと結晶学を組み合わせた新規構造解析の開発であり、今年度はアルゴリズムとしての可能性を示すことが目的である。
構造解析方法のためのテストデータとして、負染色したF型ATPaseの結晶性の悪い二次元結晶からトモグラフィーによって結晶そのもののS/N比の高い三次元再構成を得ることができた。この三次元再構成データから、膜タンパク質の並びが悪い領域を三次元的に除いたのち、in sillicoの二次元結晶を作り出すことで、計算機上で結晶性の向上を図ることで結晶学的解析を適用でき、解析アルゴリズムを確立することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の予定通り、S/N比の高い画像が得られる負染色した二次元結晶に対して新しく開発した解析方法を適用したが、今後は氷包埋した二次元結晶を用いることで天然に近い状態の膜タンパク質を観察できるようにする。実際には、クライオトモグラフィーによるデータ収集並びに二次元結晶自体の再構成を得られるようにする。得られた氷包埋状態の再構成は染色されておらず、タンパク質と溶媒との密度差は小さく、S/N比の低いin sillicoの二次元結晶由来の投影像が得られるため、本解析方法が適用できるようにプログラムの改善を進めていく。本解析法が完成した暁には、従来捨てられていた結晶性の悪い二次元結晶でも立体構造解析が可能になり、脂質膜内での膜タンパク質の構造情報を取得できるようになることが期待される。
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