2018 Fiscal Year Research-status Report
Involvement of taste receptor in oogenesis and early development
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17K19354
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
山下 敦子 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (10321738)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | 味覚受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
H30年度は、流水飼育システムを構築し、メダカ飼育環境を整えた。その上で、味覚受容体遺伝子遺伝子編集メダカが産卵した受精卵の発生時に異常が見られた表現型を再現するため、同じ部位を標的とし、CRISPR/Cas9法で変異を導入する追試を実施した。前回表現型が得られたd-rR/TOKYOと新たに実施するOK-Cabの２系統で遺伝子編集を実施したが、成育後の交配で得られた受精卵に同じ表現型は見られず、それ以外の発生や行動などにも目立った異常は見られなかった。また、実験したうち正常な産卵が見られた2匹のメダカについては、受精率・孵化率・稚魚の生存率について、野生型での文献値と大きな違いは見られなかった。なお、これらのG0メダカのジェノタイピングを実施した結果、産卵数および受精率が顕著に低かった1匹のG0メダカと産卵に異常の見られなかった2匹のG0メダカとで、味覚受容体に導入されていた変異は同一であったことから、産卵能と味覚受容体変異との関係性は判明しなかった。さらに遺伝子編集メダカの交配を進めたが、H30年度内に得られたF1世代、F2世代においては、発生や行動などに目立った表現型は得られなかった。これらの結果から、味覚受容体遺伝子編集メダカが産卵した受精卵で見られた発生異常は、味覚受容体変異によって一般的に起こる現象ではなく、当該の変異メダカに導入された特異的な変異が原因であった可能性、当該メダカの生殖系に特異的に導入された変異が原因であった可能性、当該メダカの特異的な遺伝的背景が必要である可能性が示唆された。
上述の実験に加え、味覚受容体ノックアウトメダカの系統化を目指し、F1世代のジェノタイピングを実施し、交配を進めるとともに、遺伝子編集による追試をさらに進めるため、異なる部位を標的とするガイドRNAを設計し、受精卵へのインジェクションを実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
H30年度は、異なる2系統について味覚受容体遺伝子編集の追試を実施し、本研究課題の目的となる発生時に異常の見られる卵を産卵する表現系の取得を試みたが、残念ながら期待される表現系を示した個体は得られなかった。また、H30年度中に、これらの遺伝子編集メダカからF1, F2世代まで交配を進めたが、現在までのところでは、これらの世代についても目立った異常は見られておらず、味覚受容体と卵形成・発生との関連性はまだ明確になっていない。これらの状況から、本課題は現在のところ当初の計画よりやや遅れていると自己評価する。
一方、H30年度には飼育環境を構築し、正常なメダカであればH29年度と比較して生存率が高い状況でメダカを維持できる研究環境を整えた。また、上述のように味覚受容体遺伝子編集メダカの交配を進めており、H31年度前半にはホモノックアウトメダカを確立できる見込みである。ホモノックアウトメダカを用いて、ヘテロノックアウトメダカや野生型メダカと比較した表現型比較が可能になることで、味覚受容体と卵形成・発生との関連性がこれまでより明確にできるものと考えられることから、当初の研究目的の達成を目指す予定である。さらに、「今後の研究の推進方策」に示すように、作製したノックアウトメダカについて、卵形成・発生に限定しない表現型解析を実施することで、味覚受容体の生体内での幅広い器官における生理機能解明という、本課題の目的よりも一段視野を広げた目的での成果達成を目指すことも検討する。
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| Strategy for Future Research Activity |
H30年度に交配を進めた味覚受容体遺伝子編集メダカのF2世代のジェノタイピングとさらなる交配を進め、味覚受容体ホモノックアウトメダカ系統の作製を行う。味覚受容体ホモノックアウトメダカが得られれば、以前発生に異常が見られたときと同様に野生型オスメダカとの交配を行い、以前得られた表現型が再現できるかどうかを確認する。加えて、卵形成や初期発生時などの表現型を確認するだけではなく、食餌行動など、その他の生理機能や行動などに異常が見られるかどうかを、ヘテロノックアウトメダカや野生型メダカと比較した表現型解析を実施する。何らかの生理機能に異常が見られれば、その生理機能に関連する組織・器官での味覚受容体の発現を野生型のメダカの免疫染色により確認するとともに、ノックアウトメダカと野生型メダカを解剖学的に比較し、組織・器官形成への異常の有無を確認する。これらの解析から、生体内の様々な組織における味覚受容体の発現と生理機能との関係を明らかにする。
一方、H30年度の解析の結果から、以前観察された発生時に異常を示す表現系は、味覚受容体への変異導入により一般的に起こる現象ではなく、当該メダカのみに導入された変異など、何らかの特異的な条件が関わる可能性も示唆された。そこで、当該メダカで見られた変異型味覚受容体の発現解析や機能解析を実施し、卵形成・発生時異常が見られたメダカが持っていた味覚受容体機能の様相を解明する。さらに、CRISPR/Cas9法での遺伝子編集時において、当該変異が得られる確率が低い可能性も勘案し、CRISPR/Cas9法による多重変異同時導入や、プロモーター領域への変異導入などにより、引き続き同じ表現型が見られるG0メダカの作製も試みる。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた要因として最も大きいのは人件費である。これは、当初、味覚受容体遺伝子編集メダカ作製の追試実験時に、目的とする表現型を示すメダカが得られることを期待し、表現型が得られたメダカの系統化と得られたメダカを用いた各種改変メダカ作製のための実験補助のため、実験補助員雇用を計画していたものである。しかし、当初の見込みと異なり、H30年度内に目的とする表現型を示す遺伝子改変メダカが得られなかったため、実験補助員雇用を見送る結果となった。
一方、今後の推進計画では、H31年度に味覚受容体ホモノックアウトメダカが作製できる見込みであり、H30年度に予定していた系統化のためのジェノタイピング作業や、変異メダカの維持管理作業が、H31年度にずれ込んで実施することとなった。この実験実施のために実験補助が必要である。そこで、当初予定では、H31年度は実験補助員雇用を予定していなかったが、H30年度に使用しなかった人件費を利用してH31年度に実験補助員雇用を行い、上述の研究項目を実施する予定である。
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