Challenge to innovative gene/genome manipulation techniques by re-coding of chromosomal functional elements

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K19355
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 伊藤 隆司 九州大学, 医学研究院, 教授 (90201326)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2019-03-31
• Keywords: Cas9 / Cas12a / セントロメア

Outline of Annual Research Achievements

真核生物の染色体が機能するには、複製起点・セントロメア・テロメアの３種類の特異的配列が必要である。各配列の役割は、それぞれ複製開始・染色体分配・染色体末端保護に必要なタンパク質複合体のリクルートに他ならない。であるならば、任意の塩基配列を上記タンパク質群のリクルートシグナルとして読み換えることさえできれば、３種類の特異的配列を欠いたDNA分子であっても染色体として振る舞うことが可能な筈である。この仮説を実証するため、本研究ではCRISPR-Cas9の系を利用して、出芽酵母をモデルに複製起点とセントロメアを欠いた環状人工染色体の構築に挑戦する。
前年度に引き続き、セントロメア無しのベクターのpiggy-backingに挑戦を行ったが、dCpf1/dCas12aの効率の低さが研究上の障壁となった。gRNAの伸長による改善が２件報告された（一方は5'側への伸長、もう一方は3'側への伸長）ので、いずれについても追試を試みたが、我々の使用しているgRNAに関しては特段の効果を表すことはなかった。但し、その過程において、gRNAのin vivoにおける有効性を迅速に検出する系として、DNA切断に伴うチェックポイントによる出芽酵母細胞の形態変化が利用できること、更にRad52-GFP発現株にしておけば切断に伴って核内に明るい蛍光輝点が生じることに基づく系を構築できた。この系を用いて様々な検討を進めてゆく過程で、Cas12a活性の温度依存性曲線が鋭いピークを有することから、培養温度を25℃から上昇させることを試みた。その結果、Cas12aによる切断効率のみならずdCas12aによる視覚化においても劇的な改善が認められ、改良型のenAsCas12aの導入にも成功した。これにより、ようやくdCas12aを利用する目途が立ち、当初予定していたPiggy-backing実験の基盤が整った。