2020 Fiscal Year Research-status Report
Embryonic cell culture for molecular studies of hemipteran diffused kinetochores
| Project/Area Number |
17K19376
|
|---|
| Research Institution | Ibaraki University |
|---|
Principal Investigator |
二橋 美瑞子 (長内美瑞子) 茨城大学, 理工学研究科(理学野), 准教授 (00422402)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2023-03-31
|
| Keywords | 動原体 / 染色体 / 進化 / 昆虫 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
動原体は、細胞分裂の際、染色体を娘細胞に引っ張る紡錘糸と染色体の結合を仲介するタンパク質複合体である。多くの真核生物では動原体が染色体上の一か所に形成される。一方、動原体が染色体の全体にわたって形成される『分散型動原体』は、700種以上の動植物で確認されている。分散型動原体は、染色体の切断への耐性や、近縁種間での染色体数の多様化に影響していると考えられている。ただし、分散型動原体の分子機構は線虫以外の生物では未解明な点が多い。昆虫ではトンボ目、ハサミムシ目、カメムシ目、チョウ目が互いに独立に分散型動原体を獲得しているが、機能解析はチョウ目でしか行われていない。
カメムシ目は、分散型動原体を持つ中で、唯一全身性RNAiの有効性が示されており、典型的な動原体構成タンパク質遺伝子が少なく、新規の構成要素の発見が期待できる。そこで、本研究では、ホソヘリカメムシにおいて、培養細胞の樹立と、動原体遺伝子の機能解析系の構築およびチョウ目昆虫の分散型動原体の組成と機能の比較を目指している。これまでに、再現よく胚より細胞の初代培養が可能な条件を見出すことに成功し、個体で動原体遺伝子CENP-Iの機能阻害を行い、成長阻害や精子形成、胚の有糸分裂の異常を検出している。
2020年度は、固定方法の工夫により、胚の免疫染色法に成功した。新たに4つの動原体遺伝子について、個体で機能阻害を行った結果、胚よりも幼虫の方が機能阻害の表現型が重篤になる遺伝子や、機能阻害の影響がみられない遺伝子の存在が判明した。さらに、ホソヘリカメムシのハウスキーピング遺伝子の上流配列0.9kbをinverse PCRによって単離した。並行して、比較のため、カイコ培養細胞を用いて動原体構成タンパク質遺伝子の解析を行い、動原体構成タンパク質の局在やリクルート機構について新規の知見を得るとともに、トンボで胚の免疫染色法を確立した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
コロナ禍により、学生が登校規制を一年間受けて協力を十分に得られなかった上、研究代表者もオンライン授業の対応で実験に避ける時間が限られたため、一部の実験が予定よりも遅れている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
ホソヘリカメムシ胚由来の初代培養細胞に関しては、細胞をシート状に培養する条件を検討するとともに、強制発現に用いるプロモーター配列の単離を試みる。RNAiなどの遺伝子機能解析手法についても検討する。
ホソヘリカメムシ個体の動原体遺伝子の機能解析に関しては、再現実験等を行い、結果をまとめて成果発表を行う。さらに、動原体構成タンパク質の部分長を大腸菌で発現させ、精製し、抗血清を得て、免疫染色を行い、発生ステージ、組織、細胞周期における動原体構成タンパク質の局在の比較を行う。
|
| Causes of Carryover |
コロナ禍による学生の登校規制により抗原の調製が遅れたため、予定していた抗体作製受託サービスの一部を年度内に利用しなかったので、残額が生じた。
令和3年度は、令和2年に当初予定していた抗原の調製を行い、予算は抗体作製受託サービスの外注や論文投稿などに使用する予定である。
|
