Infection sensing system with CRISPR in mammalian cell and mammalians

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K19395
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 竹田 潤二 大阪大学, 微生物病研究所, 招へい教授 (50163407)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2019-03-31
• Keywords: CRISPR / cascade / Cas3 / Cas1 / Cas2 / Adaptation

Outline of Annual Research Achievements

CRISPRシステムの進展は、ゲノム改変を容易にしただけではなく原核生物にも精巧な獲得免疫システムが備わっていた明らかにしてきた。細菌はファージなどに感染した際、ファージゲノムの一部をまず細菌ゲノムのCRISPR遺伝子座に取り込む(Adaptation)。そうする事により、次の感染に対して準備状況が備わる。すなわち、CRISPR遺伝子座のファージ由来転写産物をCasタンパク内に保持し相補DNAをターゲットにすることにより、その相補DNAを保持するファージなどを死滅させることが可能にする(Interference)。本研究では、そのAdaptationシステムを哺乳細胞で再構築し、哺乳細胞に感染する様々な微生物感染検知システムを作り上げる事を目標とした。
哺乳細胞でAdaptationを検出するためにCRISPR遺伝子座を有するプラスミドを２９３細胞に導入した。次にAdaptationに関与していると思われる遺伝子を全て哺乳細胞で至適なようにコドンを変更した。これらを全て２９３細胞に導入した。
具体的にはCas1, Cas2,Cas3, Cascade(5 genes), IHFalfa, IFHbeta, PolA, ReG, RecA-C, PriAである。
CRISPR遺伝子座のAdaptationが起きていると思われる部位をPCR法で増幅し電気泳動で確認した。陰性の結果がったので、次世代シークエンス法によりアンプリコンを解析した。今の所、Adaptationが起きていると思われるシグナルは得られていない。