2018 Fiscal Year Research-status Report
血管のメカノバイオロジー：血圧変動のライブイメージング
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17K19404
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
人見 次郎 岩手医科大学, 医学部, 教授 (00218728)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木村 英二 岩手医科大学, 医学部, 准教授 (50405750)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | 血管形成 / メカノバイオロジー / リモデリング / ゼブラフィッシュ / FRET / ライトシート顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、圧負荷をFRETプローブにより可視化することで、血管形態形成において 血流に起因する圧変動がどのように寄与しているかを明らかにすることを目的とする。血管系の発生過程は、未分化な血管網の中から血流によって動・静脈が選択されるというネットワークモデルが、長らく初期の血管形成と動静脈分化を決するメカニズムとして信じられてきたが、近年 小型魚類のゼブラフィッシュ(Danio rerio)を用いた解析結果から、初期の血管形態形成過程では、血流には依存せずに遺伝的な要素によってその形が構築されていることが報告され、血流の関与は否定された。しかしながら、血流が血管の形態形成にまったく寄与しないわけではなく、特にいったん形成された血管系のリモデリング過程では、血流が一定の割合を果たす可能性が示唆されている。これまで血管を構成している内皮細胞にどのような勾配で圧負荷がかかっているかを可視化することは不可能であり、その関係性を明確に示すことは困難であった。そこで本研究では、ゼブラフィッシュを実験モデルとして、近年 開発が進んでいるFRET を利用した圧センサープローブを血管特異的に発現させ、血管の形態形成への影響をライブイメージングによって評価する。特に、血管のリモデリング過程で、いったん形成された血管系が解離する現象への血流の関与を詳細に解析することを目的とする。我々が、これまでの観察から得た、血管系が二又に分岐している際、血流が優位に流れている血管が保持され、血流の乏しい血管は解離していくという仮説を、圧負荷を可視化することで検証することが本研究課題の目的である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度には、血圧負荷を可視化するために、Gal4-UASシステムを利用して、圧プローブ（ActTS-GR）を血管内皮で特異的に発現する遺伝子組み換えゼブラフィッシュの作成（flk1:GFF、UAS:ActTS-GR）に成功した。ActTS-GR は、細胞膜にかかる圧負荷を可視化するFRET を利用した新しい蛍光プローブで、培養細胞や、アフリカツメガエルを用いた初期発生過程での張力の可視化に成功している。平成30年度には、これらの系統を用いて血管内皮にかかる圧負荷の可視化を目指し、ライトシート顕微鏡を用いて受精後2-3日目胚を用いて観察を行った。しかしながら最適なFRETイメージングの条件を得るに至らず、蛍光（ActTS-GR）の発現量に比例したFRETイメージ像が得られたのみであった。現在 プローブ開発者である連携研究者の坪井博士、北口博士に協力していただきFRETイメージングの条件検討を進めている。平成30年度には、並行してActTS-GRをdirectに血管内皮でdriveできるコンストラクトの作成も試みた。それに先立ちより効率的に血管系でレポーター遺伝子を発現させることが可能なプロモーターの探索を行った。すなわち通常使用するflk1（kdrl）のプロモーターは7kbpあり、これを5kbpまで短くしたコンストラクトを作成した。作成したkdrl_shortP:EGFPを1細胞期の受精卵にインジェクションしたところ非常に高効率でトランジェントでのEGFPの発現が確認できた。またF0世代のスクリーニングでも20-30%の高確率でfounderが得られた。このプロモーターを用いたコンストラクト（kdrl_shortP;ActTS-GR）を作成し、現在系統の樹立を進めている。この系統を用いることでより早期の循環開始直後の圧変動もイメージング可能となることが期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和元年度には、前年度に継続して、作成した系統を用いて、FRETイメージングの条件最適化を行い、リアルタイムでの血管壁にかかる圧変動を可視化する実験系を構築する。まずは連携研究者でありプローブの開発者でもある東大の坪井博士、東工大の北口博士に協力していただき、FRETイメージの条件の最適化を行う。条件の最適化が完了次第、全身の血管をイメージングし、部位特異的な圧変動について解析を行う。また並行してより強力に早期からActTS-GRを血管内皮で発現するラインの樹立も進めていく。心臓の収縮関連蛋白であるtroponin T2a(tnnt2a)の発現をMorpholino antisense oligo（MO）を受精卵にインジェクションして発現を抑制した（心拍を生じない）胚や、心筋細胞内カルシウム動態を抑制する薬剤（BDM）を使用して一定時間心拍を経たのちに心拍を停止した胚などを併せて解析して、血管内皮での圧負荷の可視化する。tnnt2a を抑制して、心拍を発生開始以降まったく生じていない胚では、血管内皮の空間的な配置は維持されるが管腔形成が著しく阻害される（血圧負荷がかからない）。一方、BDM により、発生途中で心拍を阻害した場合、管腔は正常に形成され、血管内に含まれる血液のボリュームは心拍を停止しても一定期間は維持されることがわかっている（血圧負荷はかかるが、shear stress はかからない）。これらの異なった状態の胚をイメージングすることでActTS-GR の血管系に対する有効性を検証し、その後 実際の血管形成過程への圧負荷の影響を解析する。
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| Causes of Carryover |
人件費で予定していた金額から、勤務時間の調整等で残額が生じた。残金は次年度の予算と併せて人件費として使用する。
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Research Products
(2 results)
