2017 Fiscal Year Research-status Report
ヒト培養細胞を用いた網羅的スクリーニングによる細胞脱落を司る遺伝子の同定
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17K19409
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
川根 公樹 京都産業大学, 総合生命科学部, 准教授 (60362589)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | 細胞脱落 / 細胞死 / 細胞接着 / 上皮 / アポトーシス / ゲノムワイドスクリーニング / 腸管 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
上皮細胞は組織から脱落して一生を終える。脱落は、隣接細胞との相互、協調作用によって行われる “細胞社会における細胞死” であり、細胞自律的な死と異なって分子機構の解明は遅れている。加えて重要なのが、脱落過程での上皮バリア維持機構である。細胞が脱落するには脱落細胞と隣接細胞間の細胞接着が消失する必要があるが、接着の消失はバリアの破綻の恐れを孕む。これを防ぐための洗練された機構が想定されるが詳細は不明である。以上の背景のもと本研究は、ヒト上皮細胞株を用いてゲノムワイドのスクリーニングにより細胞脱落の各過程及び、その際に上皮のバリア機能を維持する機構を司る遺伝子を同定することを目的とする。
本年度は(1)脱落の各過程を司る遺伝子のスクリーニング、(2)細胞が脱落する際に上皮バリアの維持を司る遺伝子のスクリーニングについて実験系の最適化を行った。具体的には、スクリーニングで使用するヒトcDNAライブラリーが使用可能なヒト上皮細胞株を検索し、無刺激で細胞脱落が起こるKYSE30細胞を解析系に用いることとした。
(1)については撮影したタイムラプス画像から自動で脱落細胞数をカウントするアルゴリズムの構築に着手した (理化学研究所 望月博士との共同研究)。明視野の画像において脱落する細胞ではその輝度が上昇することに着目し、各時間フレームごとの各ピクセルの輝度の変化を評価することで脱落を検出するプログラムを構築しており現在その精度を検証中である。
(2)については、蛍光標識デキストランを培地に添加し、その細胞境界への侵入の有無でバリア破綻を評価する実験系を樹立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
(1)脱落の各過程を司る遺伝子のスクリーニング、(2)細胞が脱落する際に上皮バリアの維持を司る遺伝子のスクリーニング、の(1)について、細胞脱落が抑制あるいは亢進されたかどうかの判断を、タイムラプス画像をアルゴリズムによって自動解析することとした。そのためアルゴリズムの構築に時間を要すこととなり、その分スクリーニングの開始が遅れ、『やや遅れている』と自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
タイムラプス画像から自動で脱落細胞数をカウントするアルゴリズムが完成し次第、スクリーニングを開始する。(1)脱落の各過程を司る遺伝子のスクリーニングについては、KYSE30上皮培養細胞にウイルスベクターを感染させ、細胞がcofluentに達した後、タイムラプス画像を撮影する。撮影した画像から、アルゴリズムを用いてスクリーニングにおいて導入したcDNAが細胞脱落に与える影響を自動評価する。(2)細胞が脱落する際に上皮バリアの維持を司る遺伝子のスクリーニングについては蛍光標識でキストランを用いたアッセイ系により評価を行う。
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| Causes of Carryover |
今年度の研究において、一部の実験について、予定よりも順調に研究が進捗したため、必要経費を削減することができた。よって、本年度の進捗を受け、来年度の研究計画をより一層効率的に推進する目的で、上記の額について、本年度よりも次年度に使用することが望ましいと考えた。
次年度は、培養細胞を用いたスクリーニングを本格的に開始するため、培養細胞実験用の血清、培養プレート、遺伝子導入のためのDNA抽出キット等の消耗品が大量に必要となる。またスクリーニングのスピードを加速するため、スクリーニングでのルーチン作業を、アルバイトを雇用して実施してもらう計画である。加えて、共同研究先(東京)で一部の実験を行うため、出張のための旅費が必要となる。 繰越額をこれらにあてることで 次年度の研究がより迅速に進展することが期待出来る。
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Research Products
(3 results)
