2017 Fiscal Year Research-status Report
Development of curative therapy for polyglutamine disease by CAG repeat genome engineering
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17K19465
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| Research Institution | Aichi Medical University |
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Principal Investigator |
岡田 洋平 愛知医科大学, 医学部, 准教授 (30383714)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / 神経変性疾患 / ポリグルタミン病 / 根治的治療法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（1）培養細胞株におけるCAGリピート編集
CRISPR/Cas9を用いて、ヒト筋芽細胞株：Hu5/KD3におけるCAGリピート編集（ゲノム編集）を行った。すなわち、ゲノム二本鎖切断酵素（ヌクレアーゼ）である化膿性連鎖球菌由来SpCas9、標的の配列を認識させるガイドRNA（sgRNA）、ゲノムにノックインするARの伸長CAGリピート配列（AR55Q, 97Q）を含むDonor DNAを細胞に導入して薬剤選択を行い、CAGリピートの伸長したノックイン株を樹立した（AR24Q→AR55/97Q）。クローン選択後に、PiggyBac transposaseを用いて、ゲノム/Donor DNA中に挿入された薬剤選択カセットを除去した。現在、樹立した株を用いて、骨格筋分化についての解析を進めている。
（2）SBMA疾患特異的iPS細胞におけるCAGリピートの短縮
同様の方法でSBMA疾患特異的iPS細胞におけるCAGリピート編集（短縮：AR55Q→AR24Q）を行った。薬剤カセット除去後のクローンにおいて、PCRおよびシークエンス解析によるノックイン、および薬剤選択カセット除去の確認、および、RT-PCR、Western blottingによる正常ARの発現確認を進めている。今後、ゲノム編集後のiPS細胞を運動ニューロンへと分化誘導し、SBMA患者由来運動ニューロンでこれまでに観察されている表現型のレスキューを解析する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞株におけるゲノム編集は成功しており、またヒトiPS細胞のゲノム編集についても、概ね順調に進んでいると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
SBMA疾患特異的iPS細胞では、ゲノム編集後の細胞におけるシークエンス、および発現チェックによるCAGリピートの正常化を確認できたら、CAGリピートを正常化したiPS細胞を運動ニューロンへと分化誘導し、表現型のレスキューの解析へと進める予定である。
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| Causes of Carryover |
効率的に実験を進められたため、次年度使用額が生じた。翌年度分と合わせて、実験試薬や実験器具等の消耗品の購入、研究技術員の雇用等にあてる予定である。
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[Presentation] Pathophysiological analysis of skeletal muscles in spinal bulbar muscular atrophy by genome editing of CAG repeats2017
Author(s)
Tanaka S, Ito T, Ota A, Sone T, Shimojo D, Imagama S, Hosokawa Y, Doyu M, Okano H, Okada Y
Organizer
Society for Neuroscience Annual Meeting, Neuroscience
Int'l Joint Research
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