2017 Fiscal Year Research-status Report
Development of coupled assay-based fluorescent probes to monitor post-translational modification reactions in live cells
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17K19477
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
小松 徹 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 特任助教 (40599172)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | ケミカルバイオロジー / 酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では，各種翻訳後修飾を担う種々の酵素群の活性を生細胞で可視化する技術の開発を目指す．具体的には，特定の翻訳後修飾の有無を見分けて代謝反応を起こす酵素の発見と，これを蛍光変化に繋げる蛍光プローブの開発により，生細胞ではたらくcoupled assay系という新たな概念に基づく代謝活性の可視化を目指す．
当研究室では，近年，癌の悪性化因子としてその機能解明が待たれる酵素protein L-isoaspartyl methyltransferaseの活性可視化のため，本酵素によるisoaspartyl基のメチル化の有無によりcaspase-3による代謝活性が異なる蛍光プローブを開発し，これによるcoupled assayの活性評価系を確立してきた．現在，本coupled assay系を発展させ，これを生細胞系ではたらかせるための新たな酵素，基質配列の探索を進めるとともに，本coupled assay系をより多様な翻訳後修飾の評価系の開発に利用する研究展開を図っている．これまでに，生細胞で発現させることが可能である酵素TEV proteaseを用いたcoupled assay系の開発に焦点を当てて開発を進め，基質認識ペプチドに様々な修飾を付与した際の本酵素の基質認識の変化を詳細に理解する実験系を立ち上げ，各種翻訳後修飾の可視化の基盤とする理解を得ることができた．
また，これと併せて，上記のcoupled assayの系を用いて，生細胞のメチル化反応の共通の補酵素として各種メチルトランスフェラーゼの活性に影響を与えるS-adenosylmethionine（SAM）の検出系を開発し，生細胞のSAM濃度変動の理解を可能とする実験系を確立することに成功した．これを発展させることで，生細胞でのSAM濃度変動がどのように変化しているかを明らかにする研究展開が可能となることが期待される．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究では，「生細胞系のcoupled assay」という概念の確立を目指し，これに用いることのできる各種酵素－プローブペアの開発を進めていく．
初年度にあたる本年度は，これまでに確立してきたcoupled assayの仕組みを発展させ，生細胞で利用可能な酵素であるTEV proteaseを利用した活性評価系の開発を目指し，この酵素の基質認識能を詳細に理解する系の開発と，各種翻訳後修飾を含むペプチドの代謝活性の評価を進めてきた．LC-MSを用いた活性評価系を確立し，数十種類の各種翻訳後修飾を含む基質候補ペプチドについて代謝活性の評価をおこない，その基質認識に対する影響を広く理解すると共に，これらのうちからいくつかの，翻訳後修飾可視化系の開発につながり得るペプチド配列を見出すことに成功した．
また，本研究を発展させ，近年，特に各種メチル化反応の活性異常と関連して重要性が示唆されている代謝物S-adenosylmethionineの生細胞での変化を評価する実験系の確立にも成功した．これは，当初の研究計画には記載のないものであったが生細胞のSAM濃度を制御する化合物をスクリーニングにより取得する実験系への発展が期待できる重要なものであり，来年度以降，実験系の完成と実用化を目指す．
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| Strategy for Future Research Activity |
上記のとおり，TEV proteaseを用いたcoupled assay系の開発に必要な基盤技術，基礎知識の整備が完了したことから，次年度以降，本格的な探索研究へと歩を進める．また，TEV protease以外にも，coupled asasyに使うことのできる種々の酵素は生体内に存在することが期待され，これらについて，これまでに当研究室で開発を進めてきた酵素の探索系を活かした探索研究を進めていく予定である．
S-adenosylmethionine（SAM）の濃度制御系については，現在までに確立したSAM濃度検出系の更なる高感度化，高精度化をもって，スクリーニング系を開発し，細胞内のメチル化反応を広範に制御する重要な代謝物であるSAMの細胞内濃度が生細胞中でどのように制御されており，これが疾患と関連してどのように変動していくかを明らかにする研究へと発展させていきたいと考えている．
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