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2018 Fiscal Year Research-status Report

Development of coupled assay-based fluorescent probes to monitor post-translational modification reactions in live cells

Research Project

Project/Area Number 17K19477
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

小松 徹  東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 特任助教 (40599172)

Project Period (FY) 2017-06-30 – 2020-03-31
Keywordsケミカルバイオロジー / 創薬化学
Outline of Annual Research Achievements

本研究は,生体内の酵素活性を直接観察することを可能とする研究ツールの開発を目的として,特に,タンパク質のアミノ酸側鎖の化学修飾によってその機能を改変する翻訳後修飾を担う種々の酵素群の活性を,タンパク質,プローブペアにより検出するcoupled assayの仕組みの構築を目指しておこなわれてきた.
研究計画に記載のとおり,ウィルス由来の高選択的プロテアーゼであるTEVプロテアーゼの基質認識能を精査し,これを用いた新たなcoupled assayの仕組みについて立ち上げをおこなった.また,これと併せて,当初の計画では予定していなかった新たな側面からの研究展開として,プロテアーゼを利用したisoaspartyl基のメチル化反応の可視化プローブを細胞内補酵素の検出系に利用することで,広範なメチル基転移酵素の活性を評価することができる新たなcoupled assay系を立ち上げることに成功した.加えて,この検出系を利用して,細胞内のメチル化ポテンシャルの変化を生細胞レベルで検出する実験系を構築し,これを用いた生細胞スクリーニング系の立ち上げまでを達成した.

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

ウィルス由来の高選択的プロテアーゼであるTEVプロテアーゼの基質構造を精査するペプチドライブラリを構築し,その構造活性相関,特に,生体内で重要性を有する翻訳後修飾の可視化に資する基質構造修飾の可能性について明らかにすることに成功した.
研究計画に記載のとおり,isoaspartyl基のメチル化反応をcoupled assayによって検出する蛍光プローブについて,構造最適化を実施し,従来よりも1オーダー程度高いS/N比をもってこれを検出することができる蛍光プローブの開発を達成した.特に,この蛍光プローブがメチル化反応の可視化を高選択的に可能とするという性質に基づき,メチル化反応の補酵素として用いられるS-adenosylmethionine(SAM)の量変化を検出する実験系へとこれを転用し,その開発を達成した.近年の研究から,細胞内のメチル化反応の反応性は,その補酵素であるSAM濃度によってグローバルな制御を受けている可能性が示唆されており,SAM濃度変化は恒常性の維持,疾患の成り立ちにおいて重要な役割を果たすエピジェネティックな制御因子のひとつとして位置づけられている.本研究を通じて,ペプチド性のプローブを細胞内に導入することが困難であるという新たな課題が見出され,この点を克服することは困難であったが,代わりに,細胞を可溶化すると同時に,ここで起こる反応を可視化する実験系をもって細胞内の補酵素の検出を可能とすることに成功し,実際に,細胞の状態の変化に応じたメチル化ポテンシャルの変動をハイスループットに評価することが可能であることが確かめられた.一連のアッセイ系の確立とその応用について,現在論文投稿準備中となっている.

Strategy for Future Research Activity

本研究を通じて,ペプチド性のプローブと選択的プロテアーゼを利用したcoupled assayの仕組みについて確立することを達成したが,開発した多くのペプチド性プローブについて,細胞膜透過性を実現することが当初の予定以上に困難であることが明らかとなった.この点については,細胞の可溶化と併せることで準生理的な条件下での解析を可能としたが,より生理的な条件での変化をモニターするプローブ群を安定的に開発するためには,更なるプローブ群の開発による知見の蓄積が望まれる.一方で,本研究室を通じて,各種翻訳後修飾の可視化を可能とするアッセイ系の開発をおこなっただけでなく,これを制御する化合物を取得するためのスクリーニング系を立ち上げることまでを達成し,特に,表現型の制御において重要な役割を果たすヒストンのメチル化状態を制御することが期待される薬剤候補の取得に成功した.これらの機能を精査すると共に,構造展開をおこなって,疾患の理解と制御を可能とするケミカルバイオロジーの研究ツールとして発展させていくことが強く望まれる.

  • Research Products

    (16 results)

All 2019 2018

All Journal Article (6 results) (of which Peer Reviewed: 6 results) Presentation (10 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 10 results)

  • [Journal Article] Development and validation of an improved diced electrophoresis gel assay cutter-plate system for enzymomics studies2019

    • Author(s)
      Komatsu Toru、Shimoda Masahiro、Kawamura Yukiko、Urano Yasuteru、Nagano Tetsuo
    • Journal Title

      Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics

      Volume: 1867 Pages: 82-87

    • DOI

      10.1016/j.bbapap.2018.06.004

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Development of a Series of Practical Fluorescent Chemical Tools To Measure pH Values in Living Samples2018

    • Author(s)
      Takahashi Shodai、Kagami Yu、Hanaoka Kenjiro、Terai Takuya、Komatsu Toru、Ueno Tasuku、Uchiyama Masanobu、Koyama-Honda Ikuko、Mizushima Noboru、Taguchi Tomohiko、Arai Hiroyuki、Nagano Tetsuo、Urano Yasuteru
    • Journal Title

      Journal of the American Chemical Society

      Volume: 140 Pages: 5925-5933

    • DOI

      10.1021/jacs.8b00277

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Synthesis of unsymmetrical Si-rhodamine fluorophores and application to a far-red to near-infrared fluorescence probe for hypoxia2018

    • Author(s)
      Hanaoka Kenjiro、Kagami Yu、Piao Wen、Myochin Takuya、Numasawa Koji、Kuriki Yugo、Ikeno Takayuki、Ueno Tasuku、Komatsu Toru、Terai Takuya、Nagano Tetsuo、Urano Yasuteru
    • Journal Title

      Chemical Communications

      Volume: 54 Pages: 6939-6942

    • DOI

      10.1039/c8cc02451k

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] High-throughput single-molecule bioassay using micro-reactor arrays with a concentration gradient of target molecules2018

    • Author(s)
      Watanabe Rikiya、Komatsu Toru、Sakamoto Shingo、Urano Yasuteru、Noji Hiroyuki
    • Journal Title

      Lab on a Chip

      Volume: 18 Pages: 2849-2853

    • DOI

      10.1039/C8LC00535D

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Red-Shifted Fluorogenic Substrate for Detection of lacZ-Positive Cells in Living Tissue with Single-Cell Resolution2018

    • Author(s)
      Ito Hiroki、Kawamata Yu、Kamiya Mako、Tsuda-Sakurai Kayoko、Tanaka Shinji、Ueno Tasuku、Komatsu Toru、Hanaoka Kenjiro、Okabe Shigeo、Miura Masayuki、Urano Yasuteru
    • Journal Title

      Angewandte Chemie International Edition

      Volume: 57 Pages: 15702-15706

    • DOI

      10.1002/anie.201808670

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Rapid detection of metastatic lymph nodes of colorectal cancer with a gamma-glutamyl transpeptidase-activatable fluorescence probe2018

    • Author(s)
      Kubo Hidemasa、Hanaoka Kenjiro、Kuriki Yugo、Komatsu Toru、Ueno Tasuku、Kojima Ryosuke、Kamiya Mako、Murayama Yasutoshi、Otsuji Eigo、Urano Yasuteru
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 8 Pages: 17781-6942

    • DOI

      10.1038/s41598-018-36062-3

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 酵素活性の網羅的解析(enzymomics)による疾患関連タンパク質の探索2018

    • Author(s)
      小松徹
    • Organizer
      レドックス研究会 2018
    • Invited
  • [Presentation] Development of enzymomics approach to search for disease-related alternation of enzymatic functions2018

    • Author(s)
      Toru Komatsu
    • Organizer
      Mass Spectrometry and Proteomics (MSP) 2018
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] ペプチド代謝活性の網羅的解析(enzymomics)による新規疾患関連タンパク質の探索2018

    • Author(s)
      小松徹
    • Organizer
      新学術領域研究「化学コミュニケーションのフロンティア」第1回若手シンポジウム
    • Invited
  • [Presentation] ペプチド代謝活性の網羅的解析(enzymomics)による疾患関連タンパク質の探索2018

    • Author(s)
      小松徹
    • Organizer
      第69回日本電気泳動学会総会シンポジウム
    • Invited
  • [Presentation] 酵素活性の網羅的解析(Enzymomics)法による疾患関連タンパク質の探索2018

    • Author(s)
      小松徹
    • Organizer
      第56回生物物理学会年会
    • Invited
  • [Presentation] Development of enzymomics approach to search for disease-related alternation of enzymatic functions2018

    • Author(s)
      Toru Komatsu
    • Organizer
      ICPAC Langkawi 2018
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 酵素活性の網羅的評価(enzymomics)による新規疾患関連タンパク質の探索2018

    • Author(s)
      小松徹
    • Organizer
      第41回日本分子生物学会年会
    • Invited
  • [Presentation] Diced Electrophoresis Gel (DEG) 法を用いた癌細胞における活性異常酵素の探索2018

    • Author(s)
      小松徹
    • Organizer
      第38回 キャピラリー電気泳動シンポジウム (SCE2018)
    • Invited
  • [Presentation] 分子夾雑の理解に基づく癌関連タンパク質のオルガネラ膜局時局在機構の解明と制御2018

    • Author(s)
      小松徹
    • Organizer
      新学術領域研究「分子夾雑の生命化学」関東地区シンポジウム
    • Invited
  • [Presentation] 酵素のはたらきを「視る」手法を開発して新たな疾患関連タンパク質を「探す」2018

    • Author(s)
      小松徹
    • Organizer
      ITbM/IGER Chemistry Workshop 2018 - Exploring the Science with Molecules
    • Invited

URL: 

Published: 2019-12-27  

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