神経伝導路の機能的同定・可視化を目指す新規手法の開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K19515
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 寺田 純雄 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (00262022)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川岸 将彦 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60323606) ; 齊藤 健太 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60374659) ; 佐藤 啓介 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60644044)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2020-03-31
• Keywords: 神経伝導路

Outline of Annual Research Achievements

哺乳類をはじめとする不透明で大型の個体において、個体活動に関連する神経伝導路の同定する普遍的な手法を確立することを目的として、遺伝子にコードされたプローブの開発を進めている。このプローブは神経活動の脱分極の有無を直接的に測定する設計になっており、複数のコンポーネントにより構成される。前年度の実験結果を引き継ぐ形で、その内の一つであるプロテアーゼ活性化型蛍光タンパク質の開発を進めている。プロテアーゼの発現の有無を制御する為、形質導入する菌株のとしてBL21(DE3)を使用し、本年度、新規に導入した大腸菌の電気穿孔装置を使用して条件検討を続行している。また、もう一つのコンポーネントの膜電位感受性プロテアーゼの開発に関し、刺激時の分子の構造変化が小さいことから、この変化を拡大することを目的として、constrained labelingと呼ばれる別途の標識技術を援用して分子デザインを行ってきた。この工夫を追加しても切れ味よく活性を制御することは困難と考えられたため、更にこのデザインに加えて新たにTEVプロテアーゼの阻害配列を利用してプロテアーゼの活性制御を行うアイデアを追加し、プロテアーゼ、阻害配列のスクリーニングを進めることとした。具体的にはTEVプロテアーゼとその近縁のプロテアーゼの双方について検討を進め、必要に応じてアミノ酸変異を入れて改変することにより、至適のプロテアーゼ改変体を作成するためのスクリーニングを行っている。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

神経伝導路の同定を目的とする遺伝子にコードされたプローブのコンポーネントの内、プロテアーゼコンポーネントの作成について特に進捗が遅れている。使用する分子の刺激時の構造変化がプロテアーゼの酵素活性を制御する為には小さく、別途独自の工夫を加える必要があることから、前年度より施行しているconstrained labelingと呼ばれる標識技術を援用した分子デザインに加えて、更にTEVプロテアーゼの阻害配列を利用したスクリーニングが必要となっているため。

Strategy for Future Research Activity

引き続きプロテアーゼ活性化型蛍光タンパク質の開発を続行すると共に、プロテアーゼコンポーネントの開発について、constrained labelingに加えてTEVプロテアーゼの阻害配列を利用した分子デザインによるスクリーニングを遂行したい。TEVプロテアーゼとその近縁のプロテアーゼの双方で、同様の検討を予定している。プロテアーゼ活性化型蛍光タンパク質の軸索移行を促進させるための、抗体様小分子の実験系についても、引き続きファージディスプレイによるスクリーニングにつき検討を進めたい。

Causes of Carryover

膜電位感受性プロテアーゼの作成に難渋しており、本格的なスクリーニング開始が遅れているため。