神経伝導路の機能的同定・可視化を目指す新規手法の開発

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K19515
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 寺田 純雄 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (00262022)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川岸 将彦 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60323606) ; 齊藤 健太 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60374659) ; 佐藤 啓介 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60644044)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2020-03-31
• Keywords: 神経伝導路

Outline of Annual Research Achievements

申請時点の想定より難易度が高いことが判明した為、計画内容を改変、修正しつつ、プローブの改良を続行している。
コンポーネントの内、プロテアーゼ活性化型蛍光タンパク質については、当初TEVプロテアーゼ活性化型蛍光タンパク質をベースとした開発を進めていたが、分割GFPを利用したTEVプロテアーゼ活性化型蛍光タンパク質（FlipGFP）を利用したものの可能性も考慮し、両者を並行して作成した。FlipGFPはケージ化されており、TEVプロテアーゼの認識配列を然るべき箇所に挿入することで、TEVプロテアーゼ依存的にアンケージできる。現在プローブの活性変化、性能比較の選択を企図している。
二つ目のコンポーネントの膜電位感受性プロテアーゼについても、同様の試行錯誤を続けている。研究室内で別プロジェクトとして開発が進んでいた別途標識技術を援用して分子デザインをやり直すこととした。これはタンパク質やペプチドを蛍光タンパク質に固く結びつける技術である。この標識技術を利用することで小さな構造変化でプロテアーゼのオン・オフを行うことを考慮した。その基本的構造を考案し、基本となる VSD と TEV プロテアーゼの融合タンパク質を作成し、培養細胞や大腸菌内での活性確認に成功した。
実際のスクリーニングは、TEVプロテアーゼ活性化型蛍光タンパク質の目処が付いた段階で入る予定であったが、多くの候補から迅速にスクリーニングする実験系も確立する必要が生じており、これについては大腸菌のコロニーでスクリーニングを行う方法と、酵母で行う方法を検討中である。