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2017 Fiscal Year Research-status Report

Regulation of channel activity of AMPA receptors by membrane microdomains as revealed by high-resolution single-molecule imaging

Research Project

Project/Area Number 17K19521
Research InstitutionGifu University

Principal Investigator

鈴木 健一  岐阜大学, 研究推進・社会連携機構, 教授 (50423059)

Project Period (FY) 2017-06-30 – 2019-03-31
KeywordsAMPA受容体 / 1分子蛍光観察 / 超解像蛍光観察 / チャネル活性
Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、1分子蛍光観察と超解像蛍光観察を組み合わせた超高精度イメージング法により、神経細胞上でのAMPA受容体(AMPAR)のイオンチャネル活性の膜微小領域内外での分布を明らかにし、シナプス可塑性を生み出す機構を解明することである。これによりAMPARがどのような膜環境下にあるときに、活性を発揮するのかを明らかにする。我々は、当該年度、AMPARの輝点同士が共局在する様子を高精度1分子観察することによって、神経細胞膜上でもAMPA受容体の4量体は安定ではなく、100ミリ秒以下の寿命であり単量体も存在することを明らかにした。特にポストシナプス上のHomer-1bドメイン以外の領域でAMPARの単量体と短寿命のダイマー、オリゴマーが検出された。これらのことは、Homer-1bドメイン上のシナプス領域中ではAMPARの運動は非常に遅いが、シナプス領域外では速い成分も存在している、という我々の実験データともよく一致している。これらのデータに基づき、刺激に応じて神経細胞が、シナプス領域内外のAMPAR密度を迅速に調整しシナプス伝達効率を変更できるのは、AMPAR単量体の速い動きが原因であるというモデルを提案した。
次にこのモデルを検証した。そのため、膜上の局所ごとのAMPARのチャネル活性の可視化を試みた。GluA1、GluA2に蛍光タンパク質カルシウムセンサーのCase12タグを付加させたタンパク質をHEK293細胞に発現させて、1分子観察の条件を探った。Case12の4分子が会合すると、輝点として観察可能で、十分なシグナル/ノイズ比が得られることを確認した。これによりAMPARサブユニットを追跡しながらグルタミン酸添加後のカルシウム流入を可視化することにより、チャネル活性を調べることができる。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

神経細胞膜上でのAMPARの短寿命ダイマー、オリゴマーの存在を確認できたことは、非常に画期的だと考えている。また、「刺激に応じて神経細胞が、シナプス領域内外のAMPAR密度を迅速に調整しシナプス伝達効率を変更できるのは、AMPAR単量体の速い動きが原因である。」というモデルを提案する上で、シナプス内外でのAMPARの拡散係数とAMPARの会合度に相関がみられたことも大きな意義がある。これらの発見によって、シナプス可塑性の機構を解明するための研究が一気に進む可能性がある。
また、AMPAR4量体ごとのチャネル活性の可視化法を検討していて、上手く行く見通しが立ってきた。当初の目標を達成しており、研究計画は順調といえる。

Strategy for Future Research Activity

蛍光タンパク質カルシウムセンサーのCase12タグを付加させたGluA1, GluA2を刺激後、1分子観察することで、チャネル活性の可視化の方法論を確立する。
その後、ポストシナプスマーカーであるHomer-1bが形成するドメインや糖脂質ドメインを高空間精度で蛍光観察する。例えば、Homer-1bを有機色素で蛍光ラベルし、超解像顕微鏡法で観察する。
これらを両方とも達成した後に、微小ドメイン内外のAMPARチャネル活性を測定する。

  • Research Products

    (13 results)

All 2018 2017

All Journal Article (6 results) (of which Peer Reviewed: 6 results) Presentation (7 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 7 results)

  • [Journal Article] Super-long single-molecule tracking reveals dynamic-anchorage-induced integrin function.2018

    • Author(s)
      Takaaki A. Tsunoyama, Yusuke Watanabe, Junri Goto, Kazuma Naito, Rinshi S. Kasai, Kenichi G. N. Suzuki, Takahiro K. Fujiwara, Akihiro Kusumi.
    • Journal Title

      Nature Chemical Biology

      Volume: 14 Pages: 497-506

    • DOI

      10.1038/s41589-018-0032-5

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Revealing the raft domain organization in the plasma membrane by single-molecule imaging of fluorescent ganglioside analogs.2018

    • Author(s)
      Kenichi G. N. Suzuki, Hiromune Ando, Naoko Komura, Akihiro Imamura, Hideharu Ishida, Makoto Kiso, Takahiro K. Fujiwara, Akihiro Kusumi.
    • Journal Title

      Methods in Enzymology

      Volume: 598 Pages: 267-282

    • DOI

      10.1016/bs.mie.2017.06.038

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Native prion protein homodimers are destabilized by oligomeric amyloid beta1-42 species as shown by single-molecule imaging.2018

    • Author(s)
      Sachin S. Tiwari, Yuki M. Shirai, Yuri L. Nemoto, Kumiko Kojima, Kenichi G. N. Suzuki.
    • Journal Title

      Neuroreport

      Volume: 29 Pages: 106-111

    • DOI

      10.1097/WNR.0000000000000916

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Synthesis of fluorescent gangliosides for the studies of raft domains.2017

    • Author(s)
      Naoko Komura, Kenichi G. N. Suzuki, Hiromune Ando, Miku Konishi, Akihiro Imamura, Hideharu Ishida, Akihiro Kusumi, Makoto Kiso.
    • Journal Title

      Methods in Enzymology

      Volume: 597 Pages: 239-263

    • DOI

      10.1016/bs.mie.2017.06.004

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Development of new ganglioside probes and unraveling of raft domain structure by single-molecule imaging.2017

    • Author(s)
      Kenichi G. N. Suzuki, Hiromune Ando, Naoko Komura, Takahiro K. Fujiwara, Makoto Kiso, Akihiro Kusumi.
    • Journal Title

      Biochim. Biophys. Acta

      Volume: 1861 Pages: 2494-2506

    • DOI

      10.1016/j.bbagen.2017.07.012

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Raft-based sphingomyelin interactions revealed fluorescent sphingomyelin analogs.2017

    • Author(s)
      Masanao Kinoshita*, Kenichi G. N. Suzuki*(*equal contribution), Nobuaki Matsumori, Misa Takada, Hikaru Ano, Kenichi Morigaki, Mitsuhiro Abe, Asami Makino, Toshihide Kobayashi, Koichiro M. Hirosawa, Takahiro K. Fujiwara, Akihiro Kusumi, Michio Murata.
    • Journal Title

      Journal of Cell Biology

      Volume: 216 Pages: 1183-1204

    • DOI

      10.1083/jcb.201607086

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 1分子観察によるラフト組織化と機能の解明2018

    • Author(s)
      鈴木健一
    • Organizer
      大阪大学蛋白質研究所セミナー生体膜の生物化学
    • Invited
  • [Presentation] 1分子観察で明らかになったガングリオシドクラスター形成とそのEGF受容体活性制御機構2017

    • Author(s)
      鈴木健一
    • Organizer
      ConBio2017
    • Invited
  • [Presentation] 細胞膜の組織化と機能:高精度1分子法による解明2017

    • Author(s)
      鈴木健一
    • Organizer
      名古屋大IGERセミナー
    • Invited
  • [Presentation] 高精度1分子イメージングで明らかになったラフト組織化と機能2017

    • Author(s)
      鈴木健一
    • Organizer
      第10回セラミド研究会
    • Invited
  • [Presentation] Unraveling of raft organization and function by single-molecule imaging.2017

    • Author(s)
      Kenichi G. N. Suzuki
    • Organizer
      International seminar on biophysics and chemical biology of biomembranes and lipid bilayers
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 細胞膜上での超高速1分子蛍光観察法2017

    • Author(s)
      鈴木健一
    • Organizer
      第55回日本生物物理学会
    • Invited
  • [Presentation] 1分子観察で明らかになったガングリオシドのクラスター形成機構とEGF受容体活性制御機構2017

    • Author(s)
      鈴木健一
    • Organizer
      第59回日本脂質生化学会
    • Invited

URL: 

Published: 2018-12-17  

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