2018 Fiscal Year Research-status Report
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17K19523
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
八代 健太 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60432506)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | 左心室心筋 / 右心室心筋 / 遺伝子発現プロファイル / 蛋白発現プロファイル / 力学特性 / Tbx5 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
左心室の心筋と右心室の心筋は、それぞれが第一心臓領域と第二心臓領域と称する胚発生上は異なる起原の前駆細胞から発生する。胚発生においても、マウスES細胞を用いた実験室レベルでの心筋分化誘導においても、この二つの細胞集団はお互いに均一に混ざり合うことはなく、各々がクラスターを形成する。この事実と、修正大血管転位症で体循環を担う本来は右室である心室が、長期経過で体循環を支えることができなくなり心不全に陥る事実から、研究代表者は右心室と左心室の心筋は元々本質的に性質が異なるとの独自の作業仮説をたてた。本研究計画では、この作業仮説を検証することを目的とした基盤研究を展開する。左右心室心筋を遺伝学的なマーキングで区別できるよう遺伝子改変が施されている独自に開発したマウスES細胞（BAC Tbx5-CreERT2/R26R-eYFP ES細胞）を用いて、環境要因による後天的差異が生じないようにin vitroで心室心筋を分化誘導し、得られた右室心筋と左室心筋の（１）網羅的遺伝子発現プロファイル、（２）網羅的蛋白発現プロファイルと、（３）力学特性、について検証する。
現在まで、研究代表者が平成２８年度まで在籍していたロンドン大学メアリ女王校で、当研究で使用するBAC Tbx5-CreERT2/R26R-eYFP ES細胞を樹立した。日本へと持ち帰ったこのES細胞株に重大な支障が生じた。ES細胞の維持培養に現在広く用いられている2i+LIF培地と呼ばれる培地を用いていたが、これにより維持してきたES細胞が、継代を重ねるごとに心筋分化の効率が著しく低下した。2i+LIFで維持されたES細胞は、エピジェネティックな状態に大きな変化を生じて、分化能に大きな影響が生じ得るとの最新の報告がある。現在、この問題を解決するための作業中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
研究計画に従い実験を開始したが、以下に述べるような不測の事態に直面したこと、研究施設を異動したこと、研究に参画する人員の不足から、進捗が大きく遅れている。英国で維持培養と心筋分化の条件が最適化されていたマウスBAC Tbx5-CreERT2/R26R-eYFP ES細胞を、日本で手に入る材料（培地、血清や薬品を含む）を用いてまずは維持培養を試みたところ、未分化性や心筋分化能に大きな劣化を起こす事態が発生していた。最新の研究報告によれば、これはES細胞の維持培養に現在広く用いられている2i+LIF培地（本研究でも使用していた）は、ES細胞のエピジェネティックな状態に変化を生じさせ、分化能に大きな影響が生じ得るとのことであり、私達もこの問題に直面しているらしいことを突き止めた。現在、この問題を解決するための作業中である。
研究代表者は、2018年11月に大阪大学より京都府立医科大学へと異動し、新しく赴任した施設で新たに研究を再開するための環境整備を行わねばならなかった。このことも研究の進展を大きく遅らせてしまった原因となった。また、この異動に伴い、新たに研究を推進するための人員も確保せねばならなくなったことも研究の進展に与えた影響は大きいと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
まずはBAC Tbx5-CreERT2/R26R-eYFP ES細胞を、心筋分化に最適な分化能を維持した状態へと戻し、心筋分化誘導のプロトコールを改めて最適化を行う。これらが完了次第、右室心筋と左室心筋をセルソーターを用いて分別し、遺伝子発現プロファイル、蛋白発現プロファイル、そして力学特性の測定に着手する。人員の不足を解消するために、積極的に大学院生のリクルートも行う。
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| Causes of Carryover |
研究計画に従い実験を開始したが、以下に述べるような不測の事態に直面したこと、研究施設を異動したこと、研究に参画する人員の不足から、進捗が大きく遅れ、研究期間を延長した。英国で維持培養と心筋分化の条件が最適化されていたマウスBAC Tbx5-CreERT2/R26R-eYFP ES細胞を、日本で手に入る試薬を用いて維持培養を試みたところ、未分化性や心筋分化能に大きな劣化を起こす事態が発生した。最新の研究報告によれば、これは現在広く用いられている（本研究でも使用していた）2i+LIF培地が原因と考えられた。現在、この問題を解決するための作業中である。
研究代表者は、2018年11月に施設を異動し、新しい赴任先で新たに研究環境整備を行わねばならず、新たに研究を推進するための人員も確保せねばならなくなった。これらが研究の進展を大きく遅らせてしまった原因となった。
まずはBAC Tbx5-CreERT2/R26R-eYFP ES細胞を、心筋分化に最適な分化能を維持した状態へと戻し、心筋分化誘導のプロトコールを改めて最適化を行う。これらが完了次第、右室心筋と左室心筋をセルソーターにて分別し、遺伝子発現プロファイル、蛋白発現プロファイル、そして力学特性の測定に着手し、これを推進するための経費として使用する。
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[Journal Article] Sox17 expression in endocardium precursor cells regulates heart development in mice.2019
Author(s)
Rie Saba, Keiko Kitajima, Lucille Rainbow, Sylvia Engert, Mami Uemura, Hidekazu Ishida, Ioannis Kokkinopoulos, Yasunori Shintani, Shigeru Miyagawa, Yoshiakira Kanai, Masami Kanai-Azuma, Peter Koopman, Chikara Meno, John Kenny, Heiko Lickert, Yumiko Saga, Ken Suzuki, Yoshiki Sawa, Kenta Yashiro.
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Journal Title
bioRxiv
Volume: -
Pages: -
DOI
Open Access
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[Presentation] SoxF class transcription factor Sox17 identifies endocardium progenitor cells and regulates the heart development in mice2018
Author(s)
Yashiro, K., Saba, R., Ishida, H., Kanai, Y., Meno, C., Koopman, P., Lickert, H., Saga, Y., Miyagawa, S., Suzuki, K., and Sawa, Y.
Organizer
American Heart Association scientific Sessions 2018
Int'l Joint Research
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[Presentation] SoxF class transcription factor Sox17 identifies endocardium progenitor cells and regulates the heart development in mice.2018
Author(s)
Yashiro, K., Saba, R., Ishida, H., Kanai, Y., Meno, C., Koopman, P., Lickert, H., Saga, Y., Miyagawa, S., Suzuki, K., and Sawa, Y.
Organizer
第82回日本循環器学会学術集会
