2017 Fiscal Year Research-status Report
ケミルミノジェネティクスによる構成的エネルギー生合成系の創出
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17K19525
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
永井 健治 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (20311350)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡野 圭子 (今井圭子) 関西医科大学, 医学部, 助教 (90454610)
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Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2019-03-31
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Keywords | 自発光植物 / 発光バクテリア / ラン藻 / 光合成 / ゼニゴケ |
Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、発光バクテリアの発光タンパク質(バクテリアルシフェラーゼ)を蛍光タンパク質と融合させて発光特性の高輝度化と多色化を実現し、発光基質の生合成系遺伝子群とともに植物に導入することで煌めく人工自発光植物を開発することである。最終的には、発光色の最適化により、自ら放つ光で高効率に光合成を行わせ、太陽光に依存しない人工光合成デバイス、さらには電気エネルギーを必要としない照明デバイスを世界に先駆けて創出することを目的とする。発光バクテリアは、唯一発光基質合成系に関わる遺伝子群が全て同定された生物で、すでにluxオペロン(発光遺伝子群)のタバコへの導入が行われている(PLoS ONE 2010)、目視可能な明るさには達していない。一方ラン藻は、高等植物と同じ酸素発生型の光合成を行う原核生物であり、形質転換が容易であり、相同組み替えによる形質転換法が確立されている。そこで本研究では、発光発光バクテリアPhotorhabdus luminescence のluxオペロン(発光遺伝子群)を用いて、①発光バクテリアルシフェラーゼの高輝度化と多色化を進め、②発光関連遺伝子群(lux遺伝子群)をラン藻に導入して自発光ラン藻を作製する。さらに③自発光ラン藻の発光強度を最適化し、④自発光ラン藻の光合成活性を評価する。最終的に、⑤発光関連遺伝子群のゼニゴケと高等植物への導入を行い、人工自発光植物を作製する。またすでに作製済みのゼニゴケについては、光合成活性を測定する。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①発光バクテリアルシフェラーゼの高輝度化と多色化、②発光関連遺伝子群(lux遺伝子群)のラン藻への導入、および、発光ゼニゴケの光合成活性の評価を行った。 ①lux遺伝子群に含まれるluxA、luxB、luxC、luxD、luxE遺伝子のうち発光タンパク質をコードする遺伝子はluxA、luxBであり、luxC、luxD、luxEが発光基質生合成系の遺伝子である。発光バクテリアルシフェラーゼの高輝度化・多色化のために、発光タンパク質luxA、luxBと蛍光タンパク質との融合タンパク質を作製した。その結果、黄緑色蛍光タンパク質Venusとの融合タンパク質が、従来よりも6倍明るい輝度を示した。 ②自発光ラン藻を作製するためには、lux遺伝子群(luxCDABE)をラン藻Synechococcus elongates PCC 7942に導入する。psbAI遺伝子あるいは機能未知遺伝子のプロモーター領域の下流にluxCDABEを連結したコンストラクトを作製し、NSIサイトに導入した。その結果、従来のluxAB とluxCDEを別々に導入した系統に比べて50倍程度明るい自発光ラン藻が得られた。今後さらに蛍光タンパク質をこの系統に導入することにより、高輝度化が可能になると期待できる。一方で、すでに研究代表者は、赤、青、緑の発光タンパク質ReNL,CeNL,GeNLをそれぞれ発現させた発光ゼニゴケを作製している。暗黒下で基質添加後に植物体からの発光が光合成活性を誘導するかどうかを酸素濃度解析システムにより測定した。その結果、ReNL発現子体においては、光化学系II活性依存的な酸素発生が誘導されることが示唆された。
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Strategy for Future Research Activity |
①発光バクテリアルシフェラーゼの高輝度化と多色化、②自発光ラン藻の発光強度の最適化、③自発光ラン藻の光合成活性の評価、④発光関連遺伝子群のゼニゴケと高等植物への導入を行う。 ①発光バクテリアルシフェラーゼの高輝度化と多色化については、前年度の「発光ゼニゴケにおける光合成活性の評価」の結果をもとに、光合成に有効な光特性を有する蛍光タンパク質と発光タンパク質(luxA、luxB)の融合タンパク質を開発する。②lux遺伝子群(luxCDABE)を導入した自発光ラン藻S. elongatesの発光強度を上げるために、前年度開発した蛍光タンパク質と融合させた高輝度発光タンパク質遺伝子(F_luxA_luxB)を導入するか、または、ラン藻ゲノムのNSIIサイトに蛍光タンパク質の遺伝子を導入し、さらに高輝度な自発光ラン藻を作製する。③これらの形質転換ラン藻について、酸素発生量に加えて、二酸化炭素固定速度を測定し光合成活性の評価を行う。④自発光ラン藻の発光強度の情報をもとに、ゼニゴケや高等植物(シロイヌナズナやタバコ)の核ゲノムや葉緑体ゲノムに発光バクテリアの遺伝子群を導入し、「自発光植物」を作製する。形質転換ベクターに用いるプロモーターは、ラン藻と同じ配列が利用できると考えているが、植物種により検討する。形質転換体のリーフディスクやプロトプラストにより酸素発生量や二酸化炭素固定速度などを測定して、光合成活性を評価し「自らの光で光合成する自発光植物」の作製を目指す。前年度の結果によっては、発光バクテリア以外の発光生物を使用するなど、計画を大きく変更する可能性もある。
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Causes of Carryover |
平成29年度はラン藻のコンストラクト作製と遺伝子導入を中心に行った。導入用ベクターを作成するために、市販のキット(Gatewayクローニングキットなど)を使用する予定であったが、分担者が所有していた導入用ベクターを利用することで、キットを購入することなく実験を進めることができたため、次年度使用額が生じた。 平成30年度は、ラン藻への形質転換だけでなく、ゼニゴケや高等植物への遺伝子導入を行うため、そのための試薬類の購入とインキュベーターなどの購入を予定している。また、高等植物への遺伝子導入のため、平成29年度に購入を見送った市販のキット(Gatewayクローニングキットなど)の購入も予定している。
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