2018 Fiscal Year Annual Research Report
Live imaging of necroptosis and the release of DAMPs
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17K19533
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
中野 裕康 東邦大学, 医学部, 教授 (70276476)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村井 晋 東邦大学, 医学部, 助教 (90287540)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2019-03-31
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| Keywords | ネクロプトーシス / FRET / SMART / MLKL / RIPK3 / イメージング / トランスジェニックマウス / ２光子顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は昨年度にネクロプトーシスをモニタリングすることのできるSMART(a Sensor for MLKL Activation by RIPK3 based on FRET)と命名したFRET biosensorの開発に成功した。そこで本年度はSMARTを発現するトランスジェニックマウスを樹立するために、ROSA26遺伝子座にCAGプロモーター下流にSMART cDNAを挿入遺伝子断片を導入した。５系統のTgマウスが樹立でき、いずれの系統でもSMART cDNA由来の蛍光タンパク質の発現をWestern blot法にて確認した。まずSMART Tgマウスから採取してきた腹腔マクロファージや、ケラチノサイトにネクロプトーシスを誘導し、FRET/CFP比の上昇が見られるかを検討したが、これらの細胞ではYFPやCFPの蛍光が弱かったために、十分な解析をすることができなかった。そこで次にin vivoでネクロプトーシスを誘導するマウスモデルを検討した。既報の論文にあるように10 ugという大量のTNFを投与することにより誘導される敗血症モデルマウスで、回腸末端から小腸にかけて著明な浮腫が誘導され、組織学的解析から腸上皮細胞にネクロプトーシスの指標となるリン酸化RIPK3のシグナルが検出された。さらにTNF投与により腸上皮障害はMlkl遺伝子欠損マウスで軽減されることから、確かにネクロプトーシスが関与していることを確認した。そこでこのモデルを用いて２光子顕微鏡を用いてin vivoでネクロプトーシスのイメージングを行った。TNF投与によりFRET/CFP比の上昇が認められる傾向にあったものの、CFPの蛍光強度がYFP比較して弱かったことからデータの信頼性に問題が残り、現在他の手法でのSMART Tgマウスの作成を行っている。
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[Journal Article] Necroptosis of Intestinal Epithelial Cells Induces Type 3 Innate Lymphoid Cell-Dependent Lethal Ileitis2019
Author(s)
Shindo R, Ohmuraya M, Komazawa-Sakon S, Miyake S, Deguchi Y, Yamazaki S, Nishina T, Yoshimoto T, Kakuta S, Koike M, Uchiyama Y, Konishi H, Kiyama H, Mikami T, Moriwaki K, Araki K, Nakano H.
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Journal Title
iScience
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] FRETバイオセンサーによるネクロプトーシス実行の１細胞イメージング2018
Author(s)
村井 晋, 山口 良文, 白崎 義隆, 進藤 綾大, 中林 修, Hildebrand Joanne, 冨田 太一郎, 赤羽 悟美, Silke John, 三浦 正幸, 中野 裕康
Organizer
第91回日本生化学会大会
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